Констатирующий эксперимент это эксперимент: Ошибка 404. Запрашиваемая страница не найдена

Исследование синонимов

• Контрольная работа подразумевает проверку объекта решающим доказательством путем тщательного изучения или испытания в контролируемых условиях и с учетом установленных стандартов. Испытание нового реактивного самолета
• Эксперимент подразумевает испытание того, будет ли вещь эффективной. Система чести была введена в качестве эксперимента и, кроме того, используется в отношении любого действия или процесса, предпринятого для открытия чего-то еще неизвестного или для демонстрации чего-то известного эксперименты в ядерной физике
• Пробный подразумевает попытку человека или вещи с целью установить ценность в реальных действиях, нанятых на пробу

Найдите другое слово для эксперимент .На этой странице вы можете найти 81 синоним, антоним, идиоматическое выражение и родственные слова для эксперимента , например: тест, проверка, исследование, исследование, попытка, демонстрация, поиск, анализ, выборка, анализ и подсказка.

Эмпирические данные: определение | Живая наука

Эмпирическое свидетельство — это информация, полученная путем наблюдения или экспериментов. Ученые фиксируют и анализируют эти данные. Процесс — центральная часть научного метода.

Научный метод

Научный метод начинается с того, что ученые формируют вопросы или гипотезы, а затем приобретают знания посредством наблюдений и экспериментов, чтобы подтвердить или опровергнуть конкретную теорию.«Эмпирический» означает «основанный на наблюдении или опыте» согласно словарю Merriam-Webster Dictionary. Эмпирическое исследование — это процесс поиска эмпирических данных. Эмпирические данные — это информация, полученная в результате исследования.

Прежде чем собирать какие-либо эмпирические данные, ученые тщательно разрабатывают свои методы исследования, чтобы гарантировать точность, качество и целостность данных. Если есть недостатки в способе сбора эмпирических данных, исследование не будет считаться достоверным.

Научный метод часто включает лабораторные эксперименты, которые повторяются снова и снова, и в результате этих экспериментов получаются количественные данные в форме чисел и статистики. Однако это не единственный процесс сбора информации в поддержку или опровержение теории.

Типы эмпирических исследований

«Эмпирические данные включают измерения или данные, собранные путем прямого наблюдения или экспериментов», — сказал Хайме Таннер, профессор биологии в колледже Мальборо в Вермонте.Для сбора эмпирических измерений и данных используются два метода исследования: качественный и количественный.

По данным Государственного университета Оклахомы, качественные исследования, часто используемые в социальных науках, исследуют причины человеческого поведения. Он включает данные, которые можно найти с помощью органов чувств. Этот тип исследования часто проводится в начале эксперимента.

По данным Копенгагенского ИТ-университета, количественное исследование включает методы, которые используются для сбора числовых данных и их анализа с использованием статистических методов.Количественные числовые данные могут быть любыми данными, в которых используются измерения, включая массу, размер или объем, согласно данным Государственного университета Среднего Запада в Уичито-Фолс, штат Техас. Этот тип исследования часто используется в конце эксперимента для уточнения и проверки предыдущего исследования.

Выявление эмпирических свидетельств

Выявление эмпирических свидетельств в экспериментах другого исследователя иногда может быть трудным. По данным библиотек Университета штата Пенсильвания, есть некоторые вещи, на которые следует обратить внимание при определении того, являются ли доказательства эмпирическими:

• Можно ли воссоздать и протестировать эксперимент?
• Есть ли в эксперименте заявление об использованной методологии, инструментах и ​​средствах контроля?
• Есть ли определение изучаемой группы или явления?

Предвзятость

Цель науки состоит в том, чтобы все эмпирические данные, собранные посредством наблюдений, опыта и экспериментов, не имели предвзятости.Сила любого научного исследования зависит от способности собирать и анализировать эмпирические данные самым беспристрастным и контролируемым образом.

Однако в 1960-х годах научный историк и философ Томас Кун продвигал идею о том, что на ученых могут влиять предшествующие убеждения и опыт, согласно Центру изучения языка и информации.

Поскольку ученые — люди и склонны к ошибкам, эмпирические данные часто собираются несколькими учеными, которые независимо воспроизводят эксперименты.Это также защищает от ученых, которые бессознательно или в редких случаях сознательно отклоняются от предписанных параметров исследования, что может исказить результаты.

Регистрация эмпирических данных также имеет решающее значение для научного метода, поскольку наука может развиваться только в том случае, если данные используются совместно и анализируются. По мнению Калифорнийского университета, экспертная оценка эмпирических данных необходима для защиты от плохой науки.

Эмпирический закон и научный закон

Эмпирические законы и научные законы часто одно и то же.«Законы — это описания — часто математические описания — природных явлений», — сказал Live Science Питер Коппингер, доцент кафедры биологии и биомедицинской инженерии Технологического института Роуза-Халмана. Согласно Словарю Мерриама-Вебстера, эмпирические законы — это научные законы, которые можно доказать или опровергнуть с помощью наблюдений или экспериментов. Итак, если научный закон можно проверить с помощью экспериментов или наблюдений, он считается эмпирическим законом.

Эмпирические, анекдотические и логические свидетельства

Эмпирические, анекдотические и логические свидетельства не следует путать.Это отдельные типы доказательств, которые можно использовать, чтобы попытаться доказать или опровергнуть идею или утверждение.

Используется логическое свидетельство, доказывающее или опровергающее идею с помощью логики. Дедуктивное рассуждение может использоваться для вывода логических доказательств. Например, «Все люди смертны. Гарольд — человек. Следовательно, Гарольд смертен».

Анекдотические свидетельства состоят из историй, пережитых человеком, которому говорят, чтобы доказать или опровергнуть точку зрения. Например, многие люди рассказывали истории о своих похищениях инопланетянами, чтобы доказать их существование.Часто анекдотические свидетельства человека невозможно доказать или опровергнуть.

Дополнительные ресурсы

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Что такое план экспериментов (DOE)?

Глоссарий качества Определение: Планирование экспериментов

Дизайн экспериментов (DOE) определяется как ветвь прикладной статистики, которая занимается планированием, проведением, анализом и интерпретацией контролируемых тестов для оценки факторов, которые контролируют значение параметра или группы параметров. DOE — это мощный инструмент для сбора и анализа данных, который можно использовать в различных экспериментальных ситуациях.

Он позволяет управлять несколькими входными факторами, определяя их влияние на желаемый выход (отклик).Управляя несколькими входными данными одновременно, DOE может идентифицировать важные взаимодействия, которые могут быть упущены при экспериментировании с одним фактором за раз. Можно исследовать все возможные комбинации (полный факториал) или только часть возможных комбинаций (дробный факториал).

Стратегически запланированный и выполненный эксперимент может предоставить большой объем информации о влиянии одного или нескольких факторов на переменную отклика. Многие эксперименты включают поддержание постоянных одних факторов и изменение уровней другой переменной.Этот подход «один фактор за раз» (OFAT) к знаниям о процессах, однако, неэффективен по сравнению с одновременным изменением уровней факторов.

Многие современные статистические подходы к планируемым экспериментам берут начало в работах Р. А. Фишера в начале 20 века. Фишер продемонстрировал, как время, потраченное на то, чтобы серьезно обдумать план и выполнение эксперимента перед его попыткой, помогает избежать часто встречающихся проблем при анализе. Ключевые концепции при создании спланированного эксперимента включают блокировку, рандомизацию и репликацию.

• Блокировка: Когда рандомизация фактора невозможна или слишком затратна, блокировка позволяет ограничить рандомизацию, выполняя все испытания с одним параметром фактора, а затем все испытания с другим параметром.
• Рандомизация: Относится к порядку, в котором проводятся испытания эксперимента. Рандомизированная последовательность помогает исключить влияние неизвестных или неконтролируемых переменных.
• Репликация: Повторение полной экспериментальной обработки, включая установку.

Хорошо проведенный эксперимент может дать ответы на такие вопросы, как:

• Каковы ключевые факторы процесса?
• При каких настройках процесс будет обеспечивать приемлемую производительность?
• Каковы ключевые, основные эффекты и эффекты взаимодействия в этом процессе?
• Какие настройки приведут к меньшим вариациям на выходе?

Поощряется повторяющийся подход к получению знаний, обычно включающий следующие последовательные шаги:

1. Схема скрининга, сужающая область оцениваемых переменных.
2. «Полный факторный» план, который изучает реакцию каждой комбинации факторов и уровней факторов, а также попытку сфокусироваться на области значений, в которой процесс близок к оптимизации.
3. Поверхность отклика, предназначенная для моделирования отклика.

Когда использовать DOE

Используйте DOE, когда есть подозрение, что более одного входного фактора влияют на выход. Например, может быть желательно понять влияние температуры и давления на прочность клеевого соединения.

DOE также может использоваться для подтверждения предполагаемых взаимосвязей между входами и выходами и для разработки прогнозного уравнения, подходящего для выполнения анализа «что, если».

Дизайн шаблона экспериментов и пример

Настройка DOE начинается с карты процесса. Компания ASQ создала шаблон дизайна экспериментов (Excel), который можно бесплатно скачать и использовать. Начните свой DOE с трех шагов:

1. Получите полное представление об исследуемых входах и выходах.Блок-схема процесса или карта процесса могут быть полезны. При необходимости проконсультируйтесь со специалистами в данной области.
2. Определите подходящую меру для вывода. Предпочтительна переменная мера. Следует избегать измерения атрибутов (пройден / не пройден). Убедитесь, что система измерения стабильна и воспроизводима.
3. Создайте матрицу дизайна для исследуемых факторов. Матрица дизайна покажет все возможные комбинации высоких и низких уровней для каждого входного фактора.Эти высокие и низкие уровни могут быть закодированы как +1 и -1. Например, для двухфакторного эксперимента потребуется 4 эксперимента:

   	Уровень входа A	Вход B, уровень
   Эксперимент 1	-1	-1
   Эксперимент 2	-1	+1
   Эксперимент 3	+1	-1
   Эксперимент № 4	+1	+1

   
   Примечание: Требуемое количество экспериментальных запусков можно рассчитать по формуле 2 ⁿ , где n — количество факторов.

   Для каждого входа определите экстремальные (но реалистичные) высокие и низкие уровни, которые вы хотите исследовать. В некоторых случаях экстремальные уровни могут выходить за рамки того, что используется в настоящее время. Выбранные экстремальные уровни должны быть реалистичными, а не абсурдными. Например:

   	-1 уровень	+1 Уровень
   Температура	100 градусов	200 градусов
   Давление	50 фунтов на кв. Дюйм	100 фунтов на кв. Дюйм

   Введите факторы и уровни эксперимента в матрицу плана.Проведите каждый эксперимент и запишите результаты. Например:

   	Температура	Давление	Прочность
   Эксперимент 1	100 градусов	50 фунтов на кв. Дюйм	21 фунт
   Эксперимент 2	100 градусов	100 фунтов на кв. Дюйм	42 фунта
   Эксперимент 3	200 градусов	50 фунтов на кв. Дюйм	51 фунт
   Эксперимент № 4	200 градусов	100 фунтов на кв. Дюйм	57 фунтов

   Рассчитайте влияние фактора путем усреднения данных, собранных на низком уровне, и вычитания его из среднего значения данных, собранных на высоком уровне.Например:

   Влияние температуры на прочность:
   (51 + 57) / 2 — (21 + 42) / 2 = 22,5 фунта

   Влияние давления на прочность:
   (42 + 57) / 2 — (21 + 51 ) / 2 = 13,5 фунтов

   Взаимодействие между двумя факторами можно рассчитать таким же образом. Во-первых, матрица дизайна должна быть изменена, чтобы показать высокий и низкий уровни взаимодействия. Уровни рассчитываются путем умножения закодированных уровней на входные факторы, действующие во взаимодействии. Например:

   	Уровень входа A	Вход B, уровень	Взаимодействие
   Эксперимент 1	-1	-1	+1
   Эксперимент 2	-1	+1	-1
   Эксперимент 3	+1	-1	-1
   Эксперимент № 4	+1	+1	+1

   Рассчитайте эффект взаимодействия, как и раньше.Влияние взаимодействия на силу: (21 + 57) / 2 — (42 + 51) / 2 = -7,5 фунтов

   Экспериментальные данные могут быть представлены в виде трехмерной гистограммы.

   Планирование экспериментов: гистограмма 3D

   Эффект каждого фактора можно отобразить на диаграмме Парето.

   Планирование экспериментов: диаграмма Парето

   Отрицательный эффект взаимодействия легче всего увидеть, когда давление установлено на 50 фунтов на квадратный дюйм, а температура установлена ​​на 100 градусов.Поддержание температуры на уровне 200 градусов позволит избежать негативного эффекта взаимодействия и поможет обеспечить прочное соединение клея.

Проведите и проанализируйте свой собственный DOE

Проведите и проанализируйте до трех факторов и их взаимодействия, загрузив шаблон дизайна экспериментов (Excel).

Резюме плана экспериментов

Более сложные исследования могут быть выполнены с DOE. Приведенный выше двухфакторный пример используется в иллюстративных целях. Подробное обсуждение DOE можно найти в Справочнике по качеству Джурана .M \), с учетом ошибки обратного расчета и экспериментальных неопределенностей { ξ }, а также любой соответствующей априорной информации I . Структурный априор p ( X | I ) может рассматриваться либо как неинформативный априор, либо как структурный априор на основе веса Больцмана; в этой работе мы используем неинформативный Джеффрис до ⁹ . Другие байесовские методы в основном использовали ансамбль с весами Больцмана ¹³ , хотя общая форма теоремы Байеса и, следовательно, другие методы признают, что возможны другие априорные значения.Причина, по которой мы решили не использовать весовые конформеры моделирования Больцмана, заключается в том, что силовые поля не особенно надежны для IDP, как мы показали ранее ⁹ . Важно отметить, что априорное распределение \ (p \ left ({\ xi _j | I} \ right) \) представляет неопределенность для каждого экспериментального и / или обратного расчета мешающего параметра ξ _j для точка данных j ; поскольку он отражает переменные неопределенности для каждого типа данных, мешающие параметры обрабатываются как гауссовская случайная величина, как описано ранее ⁹ .Наконец, \ (p \ left ({d_j | X, \ xi _j, I} \ right) \) моделирует экспериментальную точку данных d _j с учетом набора конформеров и модели для ξ _j для каждой точки данных j . При применении оценки максимального правдоподобия полная вероятность представляет собой сумму по всем точкам данных.

Прототип метода EISD был ранее разработан с использованием только данных J -связывания (JC) и химического сдвига (CS) как для свернутых белков, так и для IDP ⁹ , тогда как наш текущий метод X-EISD теперь сбалансирован не только для локальных , но контакты дальнего действия (smFRET, PRE и NOE) и глобальная информация о размере и форме (SAXS и R _h ) для более полного использования экспериментальных типов данных, используемых для характеристики IDP.Типы данных JC и CS иллюстрируют два общих способа формулирования вероятностных неопределенностей для любой экспериментальной наблюдаемой, каждый из которых использует разные модели для обратных вычислений. 2} \ right \ rangle \) и \ (\ left \ langle {\ cos \ left ({\ phi — \ phi _o} \ right)} \ right \ rangle \) относительно эталонного состояния ϕ _o и уравнение.(2) используется для сравнения с экспериментально определенным значением. В этом случае \ (A (\ mu _ {\ mathrm {A}}, \ sigma _ {\ mathrm {A}}) \), \ (B (\ mu _ {\ mathrm {B}}, \ sigma _ {\ mathrm {B}}) \) и \ (C (\ mu _ {\ mathrm {C}}, \ sigma _ {\ mathrm {C}}) \) — это обратное вычисление ξ _j параметры, рассматриваемые как гауссовские случайные величины, для которых средние значения μ _j и стандартное отклонение σ _j приведены в работе Вуйстера и Бакса ( μ _A = 6.2} \ right \ rangle + B \ left \ langle {\ cos \ left ({\ phi — \ phi _o} \ right)} \ right \ rangle + C) $$

(3)

также рассматривается как гауссова случайная величина, полученная из распределения со средним 0 и стандартным отклонением σ _Jex , которое оценивает экспериментальную неопределенность измерения J ; в этой работе σ _Jex = 0,5 Гц на основе данных J -связи для развернутого состояния домена drkN Sh4 ²⁷ .J | 0, \ sigma _ {Jex}} \ right) $$

(4)

Химические сдвиги

Подход для химических сдвигов, δ , отличается, потому что обычные обратные калькуляторы, такие как SHIFTX2 ³⁸ и SPARTA + ³⁹ , включают собственное внутреннее взвешивание для различных компонентов, используемых для поддержки -вычислить δ для каждого типа атомов, α , что исключает простую математическую форму, такую ​​как уравнение Карплюса.{\ delta _ \ alpha} \ left ({0, \ sigma _ {\ delta _ \ alpha ex}} \ right) = D _ {\ delta _ \ alpha} — q _ {\ delta _ \ alpha} — \ left \ langle {\ delta _ \ alpha} \ right \ rangle $$

(5)

— это разница между экспериментальным значением химического сдвига \ (D _ {\ delta _ \ alpha} \) и средним значением обратных вычисленных сдвигов 〈 δ _α 〉 по ансамблю с учетом ошибка обратного расчета \ (q _ {\ delta _ \ alpha} \). В этой работе она также рассматривается как гауссовская случайная величина, полученная из распределения со средним 0 и стандартным отклонением \ (\ sigma _ {\ delta _ \ alpha ex} \), которое представляет экспериментальную неопределенность измерения химического сдвига; мы предполагаем, что стандартное значение \ (\ sigma _ {\ delta _ \ alpha ex} \) = 0.3 ppm для C, Cα и Cβ и 0,03 ppm для H и Hα. В этой работе мы используем SHIFTX2 ³⁸ в качестве метода обратного вычисления химических сдвигов, но с использованием опубликованного среднеквадратичного отклонения (RMSD), которое мы недавно обнаружили для SHIFTX2 при применении к независимому набору данных по белкам ⁴⁰ из \ (\ sigma _ {q _ {\ delta _ \ alpha}} \) = 0,3–0,5 частей на миллион для атомов водорода и \ (\ sigma _ {q _ {\ delta _ \ alpha}} \) = 1,2–1,4 частей на миллион для атомов углерода, когда данные не курируются, а гомология последовательностей низкая, как и в случае IDP.{\ delta _ \ alpha} | 0, \ sigma _ {\ delta _ \ alpha ex}} \ right) $$

(6)

Можно определить, что совместное правдоподобие в конечном итоге является гауссовым с нулевым средним и стандартным отклонением \ (\ sigma _ {q _ {\ delta _ \ alpha}} + \ sigma _ {\ delta _ \ alpha ex} \). Хотя было бы удобно объединить две ошибки для определенного типа данных, это скроет тот факт, что экспериментальные неопределенности данного типа данных могут варьироваться от измерения к измерению.Следовательно, \ (\ sigma _ {\ delta _ \ alpha ex} \) может отличаться для разных измерений многих химических сдвигов, даже несмотря на неопределенность модели обратного расчета для сравнения экспериментальных данных с моделируемыми структурами \ (\ left ( {\ sigma _ {q _ {\ delta _ \ alpha}}} \ right) \) нет. Мы надеемся, что разделение двух ошибок поможет прояснить эту разницу в зависимости от предоставленных экспериментальных данных.

Ядерные эффекты Оверхаузера

Характеристика ННЭ для ВПЛ более сложна, чем для свернутых белков, из-за пониженной способности точно приписывать пиковые значения конкретным ядрам из-за эффектов усреднения структурного ансамбля ⁴¹ .Кроме того, обратный расчет NOE из моделирования может выполняться с различной степенью точности, в зависимости от того, доступна ли динамическая информация и включена ли она ¹⁶ . Когда конформационный ансамбль выводится из молекулярной динамики, можно полностью включить динамические эффекты на NOE, как мы показали ранее ^16,21,22 . Они, в свою очередь, используются для расчета оценок функций спектральной плотности для каждого конформера, что позволяет довольно точно вычислить, например, гомоядерные ¹ H– ¹ H и гетероядерные ¹ H– ¹⁵ N NOE. , а времена релаксации R1 и R2 ⁴² .При использовании только статических структур, созданных с помощью статистических моделей катушек, таких как TraDES ⁴³ или Flexible-Meccano ⁴⁴ , или любого другого метода, при котором динамическая информация недоступна, прямой обратный расчет менее строг. В этом случае гомоядерные NOE можно интерпретировать как предоставление информации о расстоянии между двумя спинами ^6,16,21 , например о расстоянии водород-водород для гомоядерных ¹ H– ¹ H NOE для оценки масштабированного ансамбля -средние значения пиковой интенсивности.

Большинство стандартных пакетов анализа ЯМР-спектроскопии ^45,46,47 преобразуют интенсивности NOE в ограничения расстояния с различной плотностью между одиночной парой атомов или парами атомов, если назначение пиков неоднозначно. Для свернутых белков ограничения расстояния далее делятся на классы, такие как сильные ограничения <3,0 Å, средние ограничения <4 Å и слабые ограничения <5 Å. Наблюдение NOE в неупорядоченном состоянии не так тесно связано с расстоянием, как в свернутом состоянии из-за преобладания динамики и быстрого обмена между конформерами.{{\ mathrm {NOE}}} | 0, \ sigma _ {{\ mathrm {NOE}} ex}} \ right) $$

(9)

на каждое дистанционное удержание. Каждый экспериментальный NOE, доступный для развернутого состояния домена drkN Sh4, ограничивает расстояние между парой протонов до <8 или 10 Å ³⁴ . Обратите внимание, что эти данные были получены из в значительной степени дейтерированных образцов с использованием длительного времени смешивания NOE, чтобы повысить вероятность того, что NOE представляют контакты между остатками, находящимися далеко друг от друга в последовательности, и приводят к более длительным ограничениям, чем типичные для стандартных NOE свернутых белков ^48,49 .

Учитывая, что NOE сформулированы как диапазоны расстояний, мы должны рассмотреть, как моделировать D _NOE и \ (\ sigma _ {{\ mathrm {NOE}} ex} \). Мы используем модель Гаусса, чтобы определить D _NOE как наиболее вероятное расстояние, то есть в середине диапазона (т.е. D _NOE = 4 или 5 Å для развернутого состояния домена drkN Sh4). Затем мы протестировали несколько значений \ (\ sigma _ {{\ mathrm {NOE}} ex} \) для представления класса расстояния, т. Е. Разделив экспериментальный диапазон 8–10 Å на коэффициент 2–5, как показано на Дополнительный рис.1. Поскольку \ (\ sigma _ {{\ mathrm {NOE}} ex} \) дополнительно ограничено, модель более точно соответствует одному намерению ограничения — наказывать наблюдаемые расстояния, которые выходят за пределы диапазона ограничения, однако также приводит к большому диапазону относительных вероятностей в пределах диапазона ограничения и может привести к слишком сильному смещению в сторону точного расстояния. И наоборот, большие значения \ (\ sigma _ {{\ mathrm {NOE}} ex} \) более точно соответствуют ожиданиям, что все расстояния в пределах диапазона ограничения должны иметь примерно одинаковую вероятность, но потенциально не в достаточной степени наказывают расстояния, которые вне зоны ограничения (дополнительный рис.1). В конечном итоге мы обнаружили, что оптимизированный результат X-EISD не особенно чувствителен к значению \ (\ sigma _ {{\ mathrm {NOE}} ex} \), и определили его, разделив экспериментальный диапазон 8–10 Å на множитель 2 (\ (\ sigma _ {{\ mathrm {NOE}} ex} \) = 4 или 5 Å). Поскольку наш простой обратный расчет фактически представляет собой просто сравнение усредненных по ансамблю расстояний моделирования с обработанными экспериментальными ограничениями расстояния, мы установили для ошибки обратного расчета небольшое значение \ (\ sigma _ {q {\ mathrm {NOE}}} \) = 0.0001 Å.

Усиления парамагнитной релаксации

Подобно NOE, усилители парамагнитной релаксации (PRE) сообщают об усредненных по ансамблю и времени расстояниях с сильным динамическим вкладом, но в отличие от NOE сигналы PRE могут быть измерены для гораздо большего диапазона расстояний ^{25, 50} . Для проведения экспериментов PRE в белок должен быть введен парамагнитный центр, например, посредством ковалентного связывания спиновой метки, обычно MTSL для IDP. Затем эксперимент сообщает о различиях в скоростях релаксации между парамагнитным активным образцом и его диамагнитным аналогом, которые преобразуются в оценки расстояний между парамагнитным центром и, чаще всего, амидными протонами каждого остатка.Множественные конструкции с меткой в ​​разных местах белка могут использоваться для обеспечения нескольких наборов ограничений. Как и в случае с NOE, PRE часто преобразуются в общие ограничения расстояния: 25–100 Å для больших расстояний и <10 Å для ограничений на короткие расстояния, а также набор среднесрочных ограничений расстояния 10–25 Å, где сигнал наиболее сильный ⁵¹ . Одна потенциальная проблема с PRE заключается в том, вызывает ли химическая модификация системы другую динамику или изменяет вес и / или вводит новые структурные субпопуляции в ансамбле IDP ²⁴ ; в то же время, тщательный выбор тега PRE и его местоположения может быть использован для минимизации этой возможности экспериментальной ошибки.Следовательно, мы предполагаем ту же модель X-EISD для PRE, что и для NOE, с \ (\ sigma _ {q {\ mathrm {PRE}}} \) = 0,0001 Å, но используя \ (\ sigma _ {{\ mathrm {PRE }} ex} \), который делит экспериментально полученный диапазон ограничения на 4 на основе данных, предоставленных для развернутого состояния домена drkN Sh4. Для этого набора данных средние расстояния PRE сосредоточены около 12,0 Å, при этом большая часть экспериментальных неопределенностей определена как \ (\ sigma _ {{\ mathrm {PRE}} ex} \) = 4,0, хотя некоторые PRE имеют \ ( \ sigma _ {{\ mathrm {PRE}} ex} \) ~ 11 Å.

Остаточные диполярные связи

Остаточные диполярные связи (RDC) между парами спинов могут предоставить полезные сигналы для предсказания локальной структуры, вызывая частичное выравнивание молекул в растворе с помощью магнитного поля ^25,26 . Для IDP наиболее часто измеряются и регистрируются RDC, полученные в результате выравнивания амида в пептидной связи. Обратный расчет RDC использует либо глобальный тензор выравнивания статических структур для всего белка, как в PALES ⁵² , либо локально с использованием фрагментов белка, как в локальном калькуляторе RDC из группы Forman-Kay ²⁶ .Поскольку было показано, что локальный обратный расчет RDC может лучше моделировать экспериментальные RDC неупорядоченных состояний при использовании меньших ансамблей структур ¹⁶ , мы используем локальный обратный вычислитель RDC из лаборатории Forman-Kay ²⁶ , чтобы получить перконформационные RDC для вектора амидной связи каждого остатка в целевом ансамбле. Для оценки X-EISD мы оцениваем неопределенность ошибки обратного вычисления \ (\ sigma _ {q {\ mathrm {RDC}}} \) = 0,9 Гц на основе стандартного отклонения, оцененного на тестовом наборе пептидов в локальном Публикация RDC ²⁶ .Мы установили \ (\ sigma _ {{\ mathrm {RDC}} ex} \) = 1.0 Гц с учетом экспериментальных данных, которые были депонированы в Protein Ensemble DataBank (pE-DB) ⁵³ для развернутого состояния домена drkN Sh4 ²⁷ .

Гидродинамический радиус

Гидродинамический радиус ( R _h ) может быть экспериментально определен путем расчета коэффициента трансляционной диффузии макромолекулы с помощью таких методов, как ЯМР с градиентом импульсного поля ²⁷ , эксклюзионная хроматография ^54,55 , или динамическое рассеяние света ⁵⁶ , а затем с использованием соотношения Стокса – Эйнштейна для вычисления усредненной по ансамблю оценки R _h .Мы используем программу HYDROPRO ⁵⁷ для расчета R _h , которая берет статические конструкции и использует модель бусинки-оболочки для оценки гидродинамических свойств. Для оценки X-EISD мы вычисляем усредненное по ансамблю обратное вычисление 〈 R _h 〉 по набору структур-кандидатов и устанавливаем экспериментальную ошибку равной \ (\ sigma _ {{\ mathrm {Rh}} ex } \) = 0,30 Å, как указано в исходной работе по домену drkN Sh4 ²⁷ . Поскольку HYDROPRO имеет ошибку +/- 4% в оценке R _h , мы присваиваем ошибку обратного расчета \ (\ sigma _ {q {\ mathrm {Rh}}} \) = 0.8 Å с учетом экспериментального значения 20,3 Å ²⁷ .

Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции

FRET ^31,32,33 сообщает о больших расстояниях между двумя ковалентно связанными красителями посредством диполь-дипольного безызлучательного переноса энергии от донорного флуорофора возбужденного состояния к флуорофору-донору. {- 1} $$

(10)

где r ₀ — фёрстеровский радиус донорно-акцепторной пары.Для измерений FRET одной молекулы (smFRET) на IDP и развернутых белках выборка распределения межфлуорофорных расстояний выполняется намного быстрее, чем типичное время усреднения эксперимента (~ 1 мс), так что только средняя эффективность FRET, 〈 E 〉, соблюдается ⁵⁸ . Следовательно, 〈 E 〉 ограничивает распределение расстояний между двумя мечеными остатками. Множественные эксперименты, состоящие из разных конструкций FRET — разных пар красителей или красителей, связанных с разными сайтами в последовательности белка, — могут быть использованы для получения множественных ограничений.Существует вероятность того, что, в зависимости от природы красителя и места маркировки, они взаимодействуют с системой и нарушают ее конформационный ландшафт ^19,20,59,60 , как это было замечено для PRE ²⁴ , но опять же могут быть тщательно выбранным, чтобы минимизировать артефакты.

〈 E 〉 может быть рассчитан обратно путем измерения расстояний от статических конструкций, расчета эффективности и последующего усреднения. Часто требуется модель, чтобы учесть разницу между расстоянием между двумя остатками, к которым будут прикреплены красители, и расстоянием между самими центрами красителя.\ ипсилон $$

(11)

где \ (r _ {\ mathrm {C}} \ upalpha — {\ mathrm {C}} \ upalpha} \) — расстояние Cα – Cα, N — количество остатков между соответствующими остатками, \ (N _ {{\ mathrm {linker}}} \) — это количество предполагаемых дополнительных аминокислот, а \ (\ upsilon \) — это показатель масштабирования Флори. Чтобы оценить неопределенность обратных вычислений \ (\ sigma _ {q {\ mathrm {FRET}}} \), мы вычисляем изменение в вычисленной на основе данных эффективности FRET, которое возникает в результате изменения параметров \ (N _ {{\ mathrm {linker }}} \), \ (\ upsilon \) и r ₀ , как описано Гомесом и его сотрудниками ⁵⁸ и дополнительно описано на дополнительном рис.2. Мы приходим к значению \ (\ sigma _ {q {\ mathrm {FRET}}} \) = 0,007 Å, и мы используем типичную оценку экспериментальной неопределенности 0,02 Å для \ (\ sigma _ {{ \ mathrm {FRET}} ex} \). ^64,65,66,67 . Наиболее известным обратным вычислителем от структуры до кривых интенсивности SAXS является программа CRYSOL ²⁸ , и для всех членов ансамбля мы вычисляем кривую интенсивности I ( Q ) как функцию импульса. передать Q , а затем усреднить, чтобы получить наблюдаемую SAXS.Для X-EISD мы обработали каждую точку интенсивности как независимое измерение, как это делается в других байесовских методах ^8,13 , и оценили в соответствии с простой формулировкой X-EISD, как отдельные химические сдвиги с помощью уравнения. (5). Неопределенность обратного вычисления \ (\ sigma _ {q {\ mathrm {SAXS}}} = 0,006 \) оценивается путем вычисления общих RMSD точек интенсивности вдоль кривой для набора оптимизированных ансамблей. Мы используем экспериментальную оценку неопределенности \ (\ sigma _ {{\ mathrm {SAXS}}, ex} \) = 0.0008–0,002, с большими неопределенностями, определенными около Q = 0, и уменьшающимися в сторону больших значений Q .

Но предположение о некоррелированных или независимых ошибках вызывает затруднения при оценке экспериментальных типов данных для X-EISD. Это связано с тем, что точки данных SAXS могут быть сильно коррелированы, учитывая близкие соседние измерения в Q , а совместная оптимизация может подавить влияние других типов данных, в которых выполняется только одно или несколько наблюдений, например.г., smFRET и гидродинамический радиус. Вместо этого мы оценили информационное содержание кривой SAXS на основе теоремы выборки Шеннона ^68,69,70 ; для заданного максимального размера системы D _max , позволяет нам оценить количество каналов Шеннона, N _s

$$ N _ {\ mathrm {s}} = D _ {{\ mathrm { max}}} \ left ({q _ {{\ mathrm {max}}} — q _ {{\ mathrm {min}}}} \ right) / \ pi $$

(12)

, что для данных SAXS домена drkN Sh4 дает N _s ~ 3.2 (X)) \), где χ учитывает экспериментальные ошибки и ошибки обратного расчета.

X-EISD, примененный к развернутому состоянию домена drkN Sh4

Чтобы оценить различные локальные и глобальные типы данных с использованием байесовского подхода X-EISD, мы рассматриваем развернутое состояние домена drkN Sh4 ^{4,27 , 31} . Домен drkN Sh4 находится в медленном обмене на шкале времени ЯМР между свернутым и развернутым состояниями в типичных буферных условиях, которые не являются денатурирующими или стабилизирующими, и в этой работе мы рассматриваем только развернутое состояние.Для химического сдвига, сцепления J- , NOE, PRE, RDC и R _h данных, из-за различных сигналов для развернутого и свернутого состояний домена drkN Sh4, мы напрямую используем только развернутое состояние. Данные ЯМР. Для SAXS мы используем процедуру, примененную Forman-Kay и соавторами ранее ²⁷ , для взятия измеренных экспериментальных данных для изменения состояния равновесия, экспериментальных данных для стабилизированного сложенного состояния и известной доли присутствующего сложенного состояния. в равновесии и вычитая эффект свернутого состояния, чтобы получить экспериментальные данные только для развернутого состояния домена.Для smFRET мы игнорируем пик на 〈 E 〉 = 1.0, представляющий свернутое состояние, и оцениваем и оптимизируем только с использованием пика при 0,55, предполагая, что эта популяция представляет развернутые конформации. Полный набор данных включает 267 химических сдвигов, 47 связей J , 93 гомоядерных ограничения расстояния NOE, 68 ограничений расстояния PRE, 28 RDC, кривую интенсивности SAXS с 37 точками данных Q, гидродинамический радиус, R _h , и данные об эффективности smFRET ³¹ .

Мы ранжируем и оптимизируем три различных начальных пула структур для развернутого состояния домена drkN Sh4. Первая представляет собой набор из ~ 100000 конформаций, состоящих из ансамбля случайных катушек, созданных путем постепенного разворачивания структуры свернутого состояния домена drkN Sh4 ⁷³ с помощью сценария CNS ^74,75 , включая 100 свернутых структур и 999900 все более развернутых структур. (называется СЛУЧАЙНЫМ). Они не были оптимизированы относительно экспериментальных данных.Мы также рассматриваем оптимизированный ансамбль, созданный с помощью программы ENSEMBLE, который состоит из 1700 конформаций и доступен через pE-DB ⁵³ (называемый ENSEMBLE). Этот набор был сгенерирован 17 независимыми оптимизациями по 100 структур каждая, начиная с больших пулов обычно случайных структур, рассчитанных с использованием программы TraDES ⁴³ , включая подмножество, которое было смещено для выборки неродной спиральной структуры, очевидной в развернутом состоянии на основе данные химического сдвига.Оптимизация была сделана для согласованности со всеми теми же типами данных ЯМР и SAXS, как описано здесь, но не с данными об эффективности smFRET. Третий стартовый пул (называемый MIXED) описан ниже.

Рисунок 1 показывает, что базовая структурная картина сильно различается между СЛУЧАЙНЫМ и АНСАМБЛЬНЫМ начальным пулом структур, например процентное соотношение типа вторичной структуры для каждого остатка, усредненное по пулу, и глобальные характеристики, воплощенные в распределении радиуса вращение.В частности, пул ENSEMBLE включает конформеры домена drkN Sh4, которые были сгенерированы TraDES с предвзятостью для ненативной спиральной склонности, и эти структуры были предпочтительно выбраны оптимизацией для согласованности с экспериментальными сдвигами, а также другими данными. Таким образом, пул ENSEMBLE характеризуется высокой склонностью к спирали для остатков 16–20 и некоторым спиральным содержанием остатков 30–45 и 50–55, в отличие от безликого ансамбля RANDOM, в котором преобладают изгибы и повороты, но нет популяции спиральных или β-листов состав.СЛУЧАЙНЫЕ исходные пулы демонстрируют бимодальное распределение R _г с 〈 R _г 〉 21,2 ± 0,8 Å, что представляет вклады свернутых, компактных и расширенных состояний, выбранных протоколом развертывания, тогда как АНСАМБЛЬ показывает очень плотное одномодальное распределение 〈 R _г 〉 18,5 ± 0,3 Å.

Склонности вторичной структуры на остаток ( a ) и радиус инерции ( b ) развернутого состояния домена sh4 drkN для неоптимизированных исходных пулов RANDOM и ENSEMBLE.Планки погрешностей показаны как ± одно стандартное отклонение для 1000 ансамблей случайной выборки по 100 конформеров в каждом из двух исходных структурных пулов без применения оптимизации баллов X-EISD.

В таблице 1 приведены оценки X-EISD и RMSD-ошибки для каждого типа экспериментальных данных для неоптимизированных исходных пулов структур RANDOM и ENSEMBLE (см. Методы), а в дополнительной таблице 1 показаны оценки и RMSD для полного пула конформеров 1700. Исходный пул ENSEMBLE, который уже был уточнен по полному набору экспериментальных данных (за исключением smFRET), по-видимому, является лучшим ансамблем по сравнению с исходным ансамблем RANDOM по показателям X-EISD и RMSD для всех типов данных.Однако ошибки экспериментальных и обратных расчетов ( σ _exp и σ _q соответственно) больше, чем RMSD, предоставленные пулом ENSEMBLE, что указывает на то, что он переоборудован для всех категорий, кроме данных smFRET для который никогда не оптимизировался. Напротив, меньшие σ _exp и σ _q по сравнению с RMSD для СЛУЧАЙНОГО неоптимизированного ансамбля показывают, что мы можем уточнить ансамбль с большей вероятностью, чем исходный СЛУЧАЙНЫЙ структурный пул, и, возможно, для PRE и smFRET также для пула ENSEMBLE.

В таблице 1 и на рис. 2 мы также приводим результаты процедуры максимизации MCMC с использованием оценки X-EISD, определяемой как сумма \ (\ log p \ left ({X, \ xi | D, I} \ right) \) для всех типов данных

$$ acc \ left ({i \ to j} \ right) = {\ mathrm {X}} {\ hbox {-}} {\ mathrm {EISD}} _j \,> \, {\ mathrm {X}} {\ hbox {-}} {\ mathrm {EISD}} _ i $$

(13)

Результаты для оптимизированных пулов RANDOM и ENSEMBLE с использованием всех экспериментальных данных. a Склонность вторичной структуры к остатку после оптимизации. Планки погрешностей показаны как ± одно стандартное отклонение для склонностей вторичных структур среди 1000 независимо нарисованных и оптимизированных ансамблей по 100 структур в каждом. b Радиус распределения инерции после оптимизации. c Кривые интенсивности МУРР для неоптимизированных и оптимизированных ансамблей по сравнению с экспериментальными данными с соответствующими ошибками, показанными с помощью планок погрешностей.

Было обнаружено, что на оптимизированный пул RANDOM положительно влияют все типы данных, и он работает лучше, чем исходный неоптимизированный пул RANDOM или даже исходные данные ENSEMBLE, что измеряется глобальными характеристиками цепочек, то есть NOE и эффективностью smFRET, которая показывает большую уплотнение в распределении R _г с 〈 R _г 〉 17,9 ± 0,3 Å (рис. 2). Однако он имеет более низкую оценку в отношении локальной структуры по сравнению с оптимизированным ENSEMBLE, что измеряется, в частности, по шкале J -сцепления и в меньшей степени по химическим сдвигам.Оптимизированный АНСАМБЛЬ лучше исходного АНСАМБЛЯ в отношении всех показателей X-EISD глобального и локального типа данных и имеет вторичное назначение, которое способствует большему количеству спиральной структуры для остатков 16–20, 30–45 и 50–55 и 〈 R _г 〉 18,0 ± 0,1 Å.

Рисунок 2 также показывает, что согласование оптимизированного СЛУЧАЙНОГО ансамбля с кривой интенсивности МУРР не так хорошо, как усредненное по оптимизированным конформерам АНСАМБЛЯ, которое почти идеально соответствует интенсивности МУРР, что находится в пределах экспериментальной ошибки.Аналогичные выводы делаются при использовании стандартной процедуры MCMC, которая допускает подъемы, acc ( i → j ) = min [1, exp ( β (X-EISD _j — X-EISD _{) i} ))], используя гиперпараметр β = 0,1, что дает ~ 50% приемлемых показателей (дополнительные рисунки 3 и 4). Хотя окончательный оптимизированный ансамбль кажется более подходящим для данных, чем оптимизированный ансамбль RANDOM, а структурный ансамбль состоит из относительно компактных конформаций с хорошо развитой вторичной структурой в частях последовательности, мы далее рассмотрим, насколько этот результат чувствителен к доступные конформеры в пуле выбора.

Таким образом, мы создали СМЕШАННЫЙ начальный пул, состоящий из 50% каждого из оптимизированных структурных пулов СЛУЧАЙНЫХ и АНСАМБЛЬНЫХ. Таблица 1 показывает, что оценки X-EISD этого неоптимизированного пула в значительной степени уступают двум оптимизированным родительским ансамблям. Однако после того же протокола оптимизации MCMC с функцией оценки X-EISD с использованием уравнения. (13), пул MIXED сдвигает свой состав до конформеров 24% RANDOM и 76% ENSEMBLE с лучшими показателями химического сдвига, которые противодействуют небольшому ухудшению показателей связывания J , которые допустимы в пределах неопределенности, по сравнению с оптимизированным родительским элементом ENSEMBLE.В результате оптимизации возникает структурная картина ансамбля с в основном теми же локальными особенностями вторичной структуры, что и у исходного ENSEMBLE, но с заметным снижением процента α-спирали для остатков 16–20, 30–45 и 50–55. , а также различие глобальных характеристик с менее компактным и более широким радиусом распределения инерции, отражающим случайный пул, с 〈 R _g 〉 = 19,3 ± 0,5 Å и профилем интенсивности МУРР в отличном соответствии с экспериментом (рис.3). Эта разница в оптимизированных структурно-конформационных пулах между MIXED и ENSEMBLE возникает из-за баланса между относительными изменениями, допускаемыми для химических сдвигов, J -связей, smFRET и NOE, учитывая их сочетание экспериментальных неопределенностей и неопределенностей обратных вычислений. Следовательно, оптимизированный ансамбль MIXED так же вероятен, как и оптимизированный результат ENSEMBLE, но с различными подгруппами структурных конформеров. Это является прекрасным примером, в котором данные и неопределенности обработки данных, обработанные с использованием байесовского формализма, могут дать альтернативные структурные гипотезы, которые могут стимулировать дальнейшие эксперименты, в отличие от методов, которые без разбора соответствуют всем экспериментальным данным.

a Склонности вторичной структуры на остаток, b радиус распределения гирации и c Кривые интенсивности SAXS развернутого состояния домена drkN Sh4 для оптимизированного смешанного ансамбля. Планки погрешностей показаны как ± одно стандартное отклонение для склонностей вторичных структур среди 1000 независимо нарисованных и оптимизированных ансамблей по 100 структур в каждом.

Метод X-EISD может также дать представление о том, какой тип экспериментальных данных является наиболее ценным для оптимизации ансамбля.Чтобы показать это, мы запускаем оптимизацию X-EISD, используя уравнение. (13) только для одного типа данных при работе с неоптимизированными стартовыми пулами RANDOM, ENSEMBLE и MIXED. Рисунки 4 и 5 показывают, что одномодовая оптимизация с одним типом данных (диагональные записи) может влиять на RMSD неоптимизированных типов данных (недиагональные записи) и предлагает интересную взаимную поддержку или разногласия между экспериментальными типами данных. Начиная с неоптимизированного СЛУЧАЙНОГО пула, прямая оптимизация химических сдвигов косвенно оптимизирует связи J , RDC и smFRET, в то время как прямая оптимизация других локальных данных, таких как J -связи, помогает поддерживать конкретные контакты, которые определяют NOE, PRE. , и smFRET (рис.4а). Однако это не взаимозависимость, то есть прямая оптимизация дальнодействующих специфических ограничений контакта недостаточна для косвенного улучшения химических сдвигов и соединений J . Следовательно, данные о химическом сдвиге и связи J очень важны для уточнения структурного ансамбля, обеспечивая локальные ограничения на то, как формируются протяженные контакты NOE, PRE и smFRET.

Среднеквадратичное отклонение (RMSD) для всех типов данных в результате максимизации оценки X-EISD только с a одиночным типом данных или b совместной оптимизацией с PRE (оранжевый) при работе с неоптимизированным ансамблем RANDOM. Среднее значение определено более 1000 ансамблей из 100 структур; числа в скобках — стандартные отклонения в оценке среди 1000 независимо оптимизированных ансамблей каждого типа данных. Погрешности экспериментальных и обратных расчетов приведены в таблице 1.

RMSD для всех типов данных в результате максимизации оценки X-EISD только с a одиночным типом данных или b совместной оптимизацией с PRE (оранжевый). Среднее значение определено более 1000 ансамблей из 100 структур; числа в скобках — стандартные отклонения в оценке среди 1000 независимо оптимизированных ансамблей каждого типа данных. Погрешности экспериментальных и обратных расчетов приведены в таблице 1.

Существует также асимметричная операция при анализе конкретных дальнодействующих контактов, таких как NOE, PRE и smFRET, и их сравнения с глобальной информацией о форме, такой как SAXS и R _h . В частности, данные smFRET и PRE наиболее значительно улучшают NOE, SAXS и R _h , вероятно потому, что экспериментальные ограничения PRE и smFRET для развернутого состояния домена drkN Sh4 намного жестче, чем NOE, и более специфичны, чем SAXS и . Р _ч .Сходный вывод был сделан в недавней работе Gomes и др., Что smFRET и PRE обеспечивают сильное влияние на вычисления ансамбля IDP, выполняемые на N-концевой области неупорядоченного белка Sic1 ¹⁸ . Хотя одномодовая оптимизация с глобальными данными SAXS и R _h предлагает взаимную выгоду друг для друга, они не дают косвенной выгоды для других локализованных или конкретных типов контактных данных. Таким образом, ни один тип данных оптимизации не может привести RMSD к известным экспериментальным погрешностям или погрешностям обратных вычислений для любого другого типа данных, и совместная оптимизация необходима для уточнения ансамбля RANDOM.

Важность смешивания локальной информации с конкретными контактными данными большого диапазона может быть проиллюстрирована с помощью двойной совместной оптимизации, которая должна стабилизировать и / или улучшить RMSD для всех остальных типов данных, которые не способствовали оптимизации. Учитывая единичные результаты оптимизации, совместная оптимизация соединений J и PRE посредством процедуры максимизации должна улучшить RMSD и способствовать оптимизации для всех других типов данных в пределах ожидаемых неопределенностей, результат, который поддерживается на рис.4b для СЛУЧАЙНОГО пула.

Эта совместная оптимизация близка к статистически оптимальной, но в конечном итоге лежащие в основе СЛУЧАЙНЫЕ конформеры недостаточны для уточнения связей J с точностью до их неопределенности. В этом случае добавление других типов контактных данных локального и дальнего действия бесполезно для дальнейшего уточнения, поскольку лежащий в основе СЛУЧАЙНЫЙ структурный ансамбль не является репрезентативным.

Далее мы рассмотрим простую и двойную оптимизацию для ансамбля MIXED.В этом случае неоптимизированный пул MIXED является лучшей отправной точкой, чем пул RANDOM, и рис. 5a показывает, что одной оптимизации с PRE почти достаточно для создания оптимизированного ансамбля, который согласуется со всеми экспериментальными неопределенностями и неопределенностями обратного расчета для всех типов данных , давая оптимизированный 〈 R _г 〉 = 19,1 ± 0,8 Å. В этом случае начальный ансамбль MIXED уже достаточно согласуется с локальными типами данных, хотя большинство типов данных имеют RMSD с большими стандартными отклонениями.На рисунке 5b показано, что совместная оптимизация PRE с smFRET очень оптимальна для уточнения ансамбля MIXED для развернутого состояния домена drkN Sh4 с точностью до неопределенностей всех типов данных, опять же в соответствии с тем, что было определено Гомесом и его сотрудниками для изначально неупорядоченного Sic1. ¹⁸ .

Фактически, независимая оценка 〈 R _g 〉 и вторичной структуры в рамках схемы двойной оптимизации с PRE поддерживает более сжатый ансамбль с большим количеством вторичной структуры и приближается к результату АНСАМБЛЯ (рис.6) с оптимизированным 〈 R _g 〉 = 18,2 ± 0,4 Å. Аналогичные выводы сделаны при оптимизации пула структур ENSEMBLE (дополнительный рис. 5).

a Склонности вторичной структуры на остаток и b радиус инерции для двойного PRE и smFRET оптимизированного MIXED ансамбля. Планки погрешностей показаны как ± одно стандартное отклонение для склонностей вторичных структур среди 1000 независимо нарисованных и оптимизированных ансамблей по 100 структур в каждом.

В целом, метод X-EISD позволяет нам утверждать, что структурный пул RANDOM недостаточен и находится вне неопределенностей локальных экспериментальных данных, таких как химические сдвиги и J -связь для развернутого состояния домена drkN Sh4. Однако, хотя экспериментальные данные действительно подтверждают локальные структурные элементы, представленные в пулах MIXED и ENSEMBLE, данные не подтверждают точный процент содержания спиралей, а вместо этого колеблются от 20 до 40% для доминирующего спирального мотива на остатках 16-20.Что еще более важно, пул MIXED поддерживает вторую популяцию неструктурированных конформеров, которая, как минимум, потребует дополнительного сбора более продвинутых экспериментов ЯМР или smFRET для исследования структурных различий между пулами ENSEMBLE и MIXED.