1.Методика «Лесенка»
Протокол индивидуальной консультации
Ф. И. О. Мурашова Таисия Николаевна (мать)
Дата рождения 08.07.1982
Дата обследования 06.03.2013
Место проведения диагностики ГУО «Ясли – сад № 12 г. Витебска»
Феноменология
“Не знаю, что дочь будет делать в школе, если в детском саду без меня находиться не может”, — так начала разговор Таисия Николаевна, мама шестилетней Вероники.
Она с трех лет ходит в сад и постоянно плачет, ей там не нравится. Успокаивается она только тогда, если я сажусь с ней рядом. Вот так мы и ходим в сад — вдвоем.
К
играм активного интереса Вероника не
проявляет, ребят чуждается. Каждое утро,
заходя в группу, она напряженно
вглядывается во все, что его окружает,
почти беззвучно здоровается и неловко
садится на краешек ближайшего стула.
Гипотеза: 1) Неадекватные требования родителей к возможностям и потребностям своего ребенка.
2) Повышенная тревожность самих родителей (“А что, если его не возьмут в школу? Что мы с ним будем делать дальше?”).
3) Предъявление ребенку противоречивых требований (“Тебе нельзя этого делать, ты еще маленький!”, “Веди себя соответственно, ты же уже взрослый!”).
Опросник по выявлению тревожности
С целью выявления тревожного ребенка используется также следующий опросник (Лаврентьева Г. П., Титаренко Т. М.).
Признаки тревожности:
Тревожный ребенок
1. Не может долго работать, не уставая.
2. Ему трудно сосредоточиться на чем-то.
3. Любое задание вызывает излишнее беспокойство.
4. Во время выполнения заданий очень напряжен, скован.
5. Смущается чаще других.
6.
Часто говорит о напряженных ситуациях.
7. Как правило, краснеет в незнакомой обстановке.
8. Жалуется, что ему снятся страшные сны.
9. Руки у него обычно холодные и влажные.
10. У него нередко бывает расстройство стула.
11. Сильно потеет, когда волнуется.
12. Не обладает хорошим аппетитом.
13. Спит беспокойно, засыпает с трудом.
14. Пуглив, многое вызывает у него страх.
15. Обычно беспокоен, легко расстраивается.
16. Часто не может сдержать слезы.
17. Плохо переносит ожидание.
18. Не любит браться за новое дело.
19. Не уверен в себе, в своих силах.
20. Боится сталкиваться с трудностями.
Суммируйте количество «плюсов», чтобы получить общий балл тревожности.
Высокая тревожность — 15-20 баллов.
Средняя — 7-14 баллов.
Низкая
Данная
методика предназначена для выявления
системы представлений ребёнка о том,
как он оценивает себя сам, как, по его
мнению, его оценивают другие люди и как
соотносятся эти представления между
собой.
Цель исследования: определить особенности самооценки ребёнка (как общего отношения к себе) и представлений ребёнка о том, как его оценивают другие люди.
Материал и оборудование: нарисованная лесенка, фигурка человечка, лист бумаги, карандаш (ручка).
Процедура исследования: Методика проводится индивидуально. Процедура исследования представляет собой беседу с ребёнком с использованием определённой шкалы оценок, на которой он сам помещает себя и предположительно определяет то место, куда его поставят другие люди.
Проведение теста: Ребенку дают листок с нарисованной на нём лестницей и объясняют значение ступенек. Важно проследить, правильно ли понял ребёнок ваше объяснение. В случае необходимости следует повторить его. После этого задают вопросы, ответы записывают.
Инструкция:
Вот лесенка. Если на ней расположить
всех ребят, то здесь (показать первую
ступеньку, не называя ее номер) будут
стоять самые хорошие ребята, тут (показать
вторую и третью) – хорошие, здесь
(показать четвертую) – ни хорошие, ни
плохие ребята, тут (показать пятую и
шестую ступеньки) – плохие, а здесь
(показать седьмую ступеньку) – самые
плохие.
На какую ступеньку ты поставишь
себя? Объясни почему». В случае затруднений
с ответом повторите инструкцию еще раз.
Обработка результатов и интерпретация
При анализе полученных данных исходите, из следующего:
Ступенька 1 – завышенная самооценка.
Она чаще всего характерна для первоклассников и является для них возрастной нормой. В беседе дети объясняют свой выбор так: «Я поставлю себя на первую ступеньку, потому что она высокая», «Я самый лучший», «Я себя очень люблю», «Тут стоят самые хорошие ребята, и я тоже хочу быть с ними». Нередко бывает так, что ребенок не может объяснить свой выбор, молчит, улыбается или напряженно думает. Это связано со слабо развитой рефлексией (способностью анализировать свою деятельность и соотносить мнения, переживания и действия с мнениями и оценками окружающих).
Ступеньки 2, 3 – адекватная самооценка
У
ребенка сформировано положительное
отношение к себе, он умеет оценивать
себя и свою деятельность: «Я хороший,
потому что я помогаю маме», «Я хороший,
потому что учусь на одни пятерки, книжки
люблю читать», «Я друзьям помогаю, хорошо
с ними играю», – и т.
Ступенька 4 – заниженная самооценка
Дети, ставящие себя на четвертую ступеньку, имеют несколько заниженную самооценку. Как правило, это связано с определенной психологической проблемой. В беседе ребенок может о ней рассказать. Например: «Я и ни хороший и ни плохой, потому что я бываю добрым (когда помогаю папе), бываю злым (когда на братика своего кричу)». Здесь налицо проблемы во взаимоотношениях в семье. «Я ни хорошая и ни плохая, потому что пишу плохо буквы, а мама и учительница меня ругают за это». В данном случае разрушены ситуация успеха и положительное отношение школьницы, по меньшей мере к урокам письма; нарушены межличностные отношения со значимыми взрослыми».
Ступеньки 5, 6 – низкая самооценка
Младших
школьников с низкой самооценкой в классе
около 8–10%. Иногда у ребенка ситуативно
занижается самооценка. На момент опроса
что-то могло произойти: ссора с товарищем,
неудачно наклеенный домик и т.
Гораздо серьезнее являются стойкие мотивированные ответы ребят, где красной линией проходит мысль: «Я плохой!» Опасность этой ситуации в том, что низкая самооценка может остаться у ребенка на всю его жизнь, вследствие чего он не только не раскроет своих возможностей, способностей, задатков, но и превратит свою жизнь в череду проблем и неурядиц, следуя своей логике: «Я плохой, значит, я не достоин ничего хорошего».
Психологу
очень важно знать причину низкой
самооценки ребенка – без этого нельзя
помочь ребенку. «Я
поставлю себя на нижнюю ступеньку
(рисует кружок на пятой ступеньке),
потому что мама говорит, что у меня
ничего не получается на занятиях в
саду».
Здесь необходима работа с родителями
школьника: беседы, в которых следует
объяснить индивидуальные особенности
ребенка.
Ступенька 7 – резко заниженная самооценка
Чтобы отнести себя к «самым плохим ребятам», нужен комплекс негативных, постоянно влияющих на ребенка факторов.
| Диагностика УУД Методика №1 «Лесенка». Методика предназначена для выявления системы представлений ребёнка о том, как он оценивает себя сам, как, по его мнению, его оценивают другие люди и как соотносятся эти представления между собой. Диагностика «Лесенка» проводится в групповой форме Групповой вариант позволяет оперативно выявить уровень самооценки. Рисунок к методике «Лесенка» Инструкция: У каждого участника – бланк с нарисованной лесенкой, ручка или карандаш; на классной доске нарисована лесенка. «Ребята, возьмите красный карандаш и послушайте задание. Вот лесенка. Представьте, что на этой лесенке стоят все ваши одноклассники. На какой ступеньке стоишь ты? Нарисуй на ней кружок». Затем повторить инструкцию еще раз. Обработка результатов: При анализе полученных данных исходите из следующего: Ступенька 1 – высокий уровень (завышенная самооценка). Она чаще всего характерна для первоклассников и является для них возрастной нормой. Ступеньки 2-4 – средний уровень (адекватная самооценка). У ребенка сформировано положительное отношение к себе, он умеет оценивать себя и свою деятельность — это нормальный вариант развития самооценки. Ступенька 5 -7 – низкий уровень (заниженная самооценка). Дети, ставящие себя на эти ступеньки, имеют несколько заниженную самооценку. Как правило, это связано с определенной психологической проблемой ученика. Чтобы скорректировать ее, необходима совместная деятельность учителя, школьного педагога-психолога, социального педагога (в случае неблагоприятной обстановки в семье). Суть педагогической поддержки педагога и его психологической помощи школьникам с низкими показателями уровня самооценки состоит во внимательном, эмоционально-положительном, одобряющем, оптимистически настроенном отношении к ним. Доверительное общение, постоянный контакт с семьей, вера в ученика, знание причин и своевременное применение способов преодоления трудностей ребенка способны медленно, но поступательно формировать адекватную самооценку младшего школьника. Методика №2 Модифицированный вариант анкеты школьной мотивации Н.Г. Лускановой. Инструкция: «Сейчас я буду зачитывать вопросы, которые описывают ваше отношение к школе. Послушайте их внимательно. К каждому вопросу предлагается 3 варианта ответа. Выберите тот вариант, который вам подходит, и запишите номер этого варианта рядом с номером соответствующего вопроса» (см. Приложение 2 «Стимульный материал для проведения мониторинга сформированности УУД у первоклассников»). Обработка результатов: Отрицательный ответ – 0 баллов; Нейтральный ответ – 1 балл; Положительный ответ – 3 балла; Максимально возможная оценка равна 30 баллам. Уровни школьной мотивации: 25–30 баллов – высокий уровень школьной мотивации; 15–24 балла – средний уровень мотивации; 10–14 баллов – низкий уровень школьной мотивации (ниже 10 баллов – негативное отношение к школе). Вопросы анкеты: 1. 1) Мне в школе нравится. 2) Мне в школе не очень нравится. 3) Мне в школе не нравится. 2. С каким настроением ты идешь утром в школу? 1) С хорошим настроением. 2) Бывает по-разному. 3) Чаще хочется остаться дома. 3. Если бы тебе сказали, что завтра в школу не обязательно приходить всем ученикам, как бы ты поступил? 1) Пошел бы в школу. 2) Не знаю. 3) Остался бы дома. 4. Как ты относишься к тому, что у вас отменяют уроки? 1) Мне не нравится, когда отменяют уроки. 2) Бывает по-разному. 3) Мне нравится, когда отменяют уроки. 5. Как ты относишься к домашним заданиям? 1) Я хотел бы, чтобы домашние задания были. 2) Не знаю, затрудняюсь ответить. 3) Я хотел бы, чтобы домашних заданий не было. 6. Хотел бы ты, чтобы в школе были одни перемены? 1) Нет, не хотел бы. 2) Не знаю. 3) Да, я хотел бы, чтобы в школе были одни перемены. 7. Рассказываешь ли ты о школе своим родителям или друзьям? 1) Рассказываю часто. 2) Рассказываю редко. 3) Вообще не рассказываю. 8. Как ты относишься к своему классному руководителю? 1) Мне нравится наш классный руководитель. 2) Не знаю, затрудняюсь ответить. 3) Я хотел бы, чтобы у нас был другой классный руководитель. 9. Есть ли у тебя друзья в классе? 1) У меня много друзей в классе. 2) У меня мало друзей в классе. 3) У меня нет друзей в классе. 10. Как ты относишься к своим одноклассникам? 1) Мне нравятся мои одноклассники. 2) Мне не очень нравятся мои одноклассники. 3) Мне не нравятся мои одноклассники. Диагностика регулятивных универсальных учебных действий Методика № 3 «Тест простых поручений». Тест диагностирует уровень развития саморегуляции, организации деятельности, отдельные свойства внимания, объем оперативной памяти. Проводится групповым способом. Инструкция: Ребята, при выполнении этих заданий вы должны быть очень внимательны и сообразительны. Ваша задача — выполнять каждое из моих несложных поручений быстро и без ошибок. Каждое поручение вы будете выполнять в одном из восьми квадратов выданного вам бланка. Если вы не успеете выполнить какое-то задание, переходите к следующему. Сделав случайную ошибку, аккуратно исправьте ее. Как только я скажу «стоп», закончите выполнение задания. Текст поручений: 1. В первом квадрате напишите первую букву слова «Сергей» и последнюю букву слова «урок». 2. Во втором квадрате впишите в треугольник знак «плюс» и поставьте рядом с треугольником цифру «один». 3. В третьем квадрате обведите в кружок первую букву в слове «картина» и подчеркните все гласные. 4. В четвертом квадрате соедините прямой линией правый верхний угол и левый нижний угол квадрата. 5. В пятом квадрате разделите пополам маленький квадрат и на четыре части большой квадрат. 6. В шестом квадрате проведите две горизонтальные линии (показать рукой направление) и две вертикальные линии (также указать рукой направление). 7. В седьмом квадрате поставьте точку в маленьком треугольнике и соедините с точкой в большом треугольнике. 8. В последнем квадрате обведите в кружок все согласные в слове «салют» и зачеркните гласные буквы в слове «дождь». Рисунок к методике «Тест простых поручений» Обработка результатов: За каждое правильно выполненное поручение присуждается 1 балл. При выполнении части поручения или незначительном искажении балл не присуждается. 7-8 баллов – высокий уровень; 4-6 баллов – средний уровень; 0–3 балла – низкий уровень. Диагностика познавательных универсальных учебных действий Методика №4 Исследование словесно-логического мышления Методика разработана Э. 1-й субтест Осведомленность Направлен на выявление осведомленности. Задания требуют от ребенка навыков дифференциации существенных и несущественных признаков предметов и простейших понятий. По результатам субтеста можно судить также о словарном развитии школьников. 2-й субтест Классификация Направлен на выявление умения классифицировать, изучение способности к абстрагированию. Инструкция: Диагностика проводится как индивидуально, так и фронтально. Текст инструкции к каждому заданию может зачитываться как самим учителем (психологом), так и детьми про себя в электронном варианте (методика Р. Амтхауэра). Перед предъявлением заданий каждого субтеста необходимо дать несколько тренировочных проб, разобрать специфику выполнения каждого субтеста. Обработка результатов. При обработке результатов исследования подсчитывается сумма баллов, полученных за выполнение отдельных субтестов, и общая балльная оценка за два субтеста в целом. Каждый правильный ответ оценивается 1 баллом. Баллы, полученные за каждый субтест, и по методике в целом сравниваются с максимально возможными показателями – 10 баллов за субтест и 20 баллов в целом. 18 — 20 баллов – высокий уровень; 10 – 17 баллов – средний уровень; 0 –9 – низкий уровень.
Ключ Стимульный материал: 1-й субтест Продолжи предложение одним из слов, содержащихся в скобках.
2-й субтест Одно из пяти слов в ряду не подходит к остальным. Вычеркни его.
Диагностика коммуникативных универсальных учебных действий Методика №5 «Рукавички» (Г.А. Цукерман). Методика предназначена на выявление уровня сформированности действий по согласованию усилий в процессе организации и осуществления сотрудничества (кооперация). Метод оценивания: наблюдение за взаимодействием учащихся, работающих в классе парами, и анализ результата. Инструкция: Учащиеся рассаживаются парами, каждому дают по одному изображению рукавички и просят украсить их одинаково, т. Обработка результатов: Низкий уровень – в узорах явно преобладают различия или вообще нет сходства. Дети не пытаются договориться, каждый настаивает на своем. Средний уровень – сходство частичное — отдельные признаки (цвет или форма некоторых деталей) совпадают, но имеются и заметные различия. Высокий уровень – рукавички украшены одинаковым или очень похожим узором. Дети активно обсуждают возможный вариант узора; приходят к согласию относительно способа раскрашивания рукавичек; сравнивают способы действия и координируют их, строя совместное действие; следят за реализацией принятого замысла. Бланк ответов Диагностика УУД в 1 классе (конец года) Ф.И.учащегося:_______________________________________________ Методика №1 «Лесенка». Методика №2 Модифицированный вариант анкеты школьной мотивации Н.Г. Лускановой.
Методика № 3 «Тест простых поручений».
Методика №4 Исследование словесно-логического мышления 1-й субтест Продолжи предложение одним из слов, содержащихся в скобках. Для этого подчеркни его.
2-й субтест Одно из пяти слов в ряду не подходит к остальным. Вычеркни его.
|
Как ты чувствуешь себя в школе?
Временные затраты на выполнение теста — 5-7 минут. Текст поручений зачитывается в обычном темпе. Каждое задание зачитывается только один раз, повтора не допускается (см. Приложение 2 «Стимульный материал для проведения мониторинга сформированности УУД у первоклассников»).
Ф. Замбацявичене на основе теста структуры интеллекта Р. Амтхауэра для диагностики умственного развития младших школьников. В предлагаемой методике 2 субтеста по 10 проб в каждом (см. Приложение 2 «Стимульный материал для проведения мониторинга сформированности УУД у первоклассников»).Влияние пуговичной канюляции по сравнению с техникой веревочной лестницы на проходимость гемодиализного доступа
Сравнительное исследование
. 2014 март; 27(2):210-6.
дои: 10.1111/sdi.12143. Epub 2013 1 октября.
Мика Р Чан 1 , Олатокунбо Шобанде, Хемендер Ватс, Морин Вакин, Синьлю Мейер, Джанет Беллингхэм, Брэд С. Астор, Александр С. Евзлин
Принадлежности
принадлежность
- 1 Отделение нефрологии, Департамент медицины, Мэдисон, Висконсин.
- PMID: 24118562
- DOI: 10.1111/сди.12143
Сравнительное исследование
Мика Р. Чан и др. Семин Циферблат. 2014 март
. 2014 март; 27(2):210-6.
дои: 10.1111/sdi.12143. Epub 2013 1 октября.
Авторы
Мика Р Чан 1 , Олатокунбо Шобанде, Хемендер Ватс, Морин Вакин, Синьлю Мейер, Джанет Беллингхэм, Брэд С. Астор, Александр С. Евзлин
принадлежность
- 1 Отделение нефрологии, Департамент медицины, Мэдисон, Висконсин.
- PMID: 24118562
- DOI: 10.1111/сди.12143
Абстрактный
Техника веревочной лестницы (RL) является наиболее распространенной техникой, используемой для катетеризации артериовенозных фистул (АВФ). Петлевая канюляция (BHC) или метод постоянного места рекомендуется в руководстве по сосудистому доступу Национального почечного фонда (NKF/KDOQI). Мы сравнили результаты первичной проходимости, эпизодов бактериемии, показателей кровотока доступа (Qa) и качества жизни (QoL) у пациентов с RL и BHC. Используя проспективно собранную базу данных сосудистого доступа, в общей сложности 45 пациентов с частым диализом с использованием BHC сравнивали с 38 пациентами с использованием метода RL в течение среднего периода 12 месяцев (межквартильный диапазон: 4-27 месяцев). Две группы существенно не различались по демографическим характеристикам, за исключением того, что диабет чаще встречался у тех, кто использовал BHC, по сравнению с веревочной лестницей (69).% против 34%; р = 0,002). Факторами риска, связанными с отсутствием первичной проходимости, были возраст (отношение рисков [ОР] = 1,02 за десятилетие; 95% ДИ: 1,00–1,03; р = 0,04) и женский пол (ОР = 1,92; 95% ДИ: 1,08–3,40; р). = 0,03). Использование техники петли не было связано с улучшением первичной проходимости (ОР = 1,22, 95% ДИ: 0,65–2,28; р = 0,53). Эпизоды бактериемии и средние баллы по KDQOL-36 существенно не отличались между группами. Это исследование впервые демонстрирует, что использование BHC не связано с улучшением проходимости доступа.
© 2013 Wiley Periodicals, Inc.
Похожие статьи
Петлевая игла гемодиализных артериовенозных фистул приводит к меньшему количеству осложнений и вмешательств по сравнению с техникой веревочной лестницы.
ван Лун М.М., Гувертс Т., Кесселс АГ, ван дер Санде Ф.М., Тордуар Д.Х. ван Лун М.М. и др. Трансплантация нефролового циферблата. 2010 Январь; 25 (1): 225-30. дои: 10.1093/ndt/gfp420. Epub 2009 29 августа. Трансплантация нефролового циферблата. 2010. PMID: 19717827
Канюлирование артериовенозных фистул с помощью петли и веревочной лестницы для гемодиализа: систематический обзор.
Вонг Б., Мунир М., Вибе Н., Стори Д., Шурроу С., Панну Н., Кларенбах С., Грудзинский А., Несраллах Г., Поли Р.П. Вонг Б. и др. Am J почек Dis. 2014 декабрь; 64 (6): 918-36. doi: 10.1053/j.ajkd.2014.06.018. Epub 2014 8 августа. Am J почек Dis. 2014. PMID: 25110302 Обзор.
Выживание артериовенозной фистулы с канюляцией петли (постоянное место) для гемодиализного доступа.
Кандил Х., Кольер С., Йевету Э., Кросс Дж., Давенпорт А. Кандиль Х. и др. ASAIO J. 2014, январь-февраль; 60 (1): 95-8. doi: 10.1097/MAT.0000000000000018. АСАИО Дж. 2014. PMID: 24281124
Клинические эффекты метода пуговичной канюляции у пациентов, находящихся на гемодиализе.
Ким М.К., Ким Х.С. Ким М.К. и др. Гемодиал Инт. 2013 апр; 17 (2): 294-9. doi: 10.1111/j.1542-4758.2012.00753.x. Epub 2012 24 сентября. Гемодиал Инт. 2013. PMID: 22998500 Клиническое испытание.
Систематический обзор практики и результатов катетеризации в петлице.
Грудзинский А., Мендельсон Д., Пьерратос А., Несралла Г. Грудзинский А. и соавт. Семин Циферблат. 2013 июль-август;26(4):465-75.
дои: 10.1111/sdi.12116.
Семин Циферблат. 2013.
PMID: 23859189
Обзор.
Посмотреть все похожие статьи
Цитируется
Влияние канюляции петли в сравнении с канюляцией веревочной лестницей у пациентов, находящихся на гемодиализе с сосудистым доступом: систематический обзор и метаанализ рандомизированных/клинических контролируемых исследований.
Ван Л.П., Цай Л.Х., Хуан Х.И., Околи С., Го С.Э. Ван Л.П. и др. Медицина (Балтимор). 2022 22 июл;101(29)):e29597. doi: 10.1097/MD.0000000000029597. Медицина (Балтимор). 2022. PMID: 35866782 Бесплатная статья ЧВК.
Петлевая канюляция артериовенозных фистул в Соединенных Штатах.
Вачхараджани Т.Дж., Вонг Л.
, Нияр В.Д., Абрео К.Д., Мокшицки М.Х.
Вачхараджани Т.Дж. и соавт.
Почки360. 2020 6 марта; 1 (4): 306-313. doi: 10.34067/KID.0000052020. Электронная коллекция 2020 30 апр.
Почки360. 2020.
PMID: 35372920
Бесплатная статья ЧВК.
Обзор.Следует ли использовать пуговичную канюляцию артериовенозных фистул? ПРОТИВ.
Макрей Дж.М. Макрей Дж. М. Почки360. 2020 14 апреля; 1 (5): 322-325. doi: 10.34067/KID.0000602019. Электронная коллекция 2020 28 мая. Почки360. 2020. PMID: 35369375 Бесплатная статья ЧВК. Аннотация недоступна.
Staphylococcus aureus Риск бактериемии у пациентов, находящихся на гемодиализе, использующих технику пуговичной канюляции: проспективное многоцентровое исследование.
Глеруп Р.
, Свенссон М., Дженсен Д.Д., Кристенсен Д.Х.
Глеруп Р. и соавт.
Почки Мед. 2019 11 сентября; 1 (5): 263-270. doi: 10.1016/j.xkme.2019.07.007. eCollection 2019 сен-окт.
Почки Мед. 2019.
PMID: 32734206
Бесплатная статья ЧВК.Артериовенозный доступ при гемодиализе: междисциплинарная перспектива для будущих решений.
Стегмайр Б., Виллемс С., Грот Т., Мартинс А., Невес Н.М., Моттаги К., Ремуцци А., Уолпот Б. Стегмайр Б. и соавт. Int J Artif Organs. 2021 янв;44(1):3-16. дои: 10.1177/0391398820922231. Эпаб 2020 22 мая. Int J Artif Organs. 2021. PMID: 32438852 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.
Просмотреть все статьи «Цитируется по»
Типы публикаций
термины MeSH
Получение цепной схемы ДНК на основе метода мультиплексной ПЦР
- Список журналов
- J Нуклеиновые кислоты
- v. 2010; 2010
- PMC2915804
J Нуклеиновые кислоты. 2010 г.; 2010: 421803.
Опубликовано онлайн 2010 2010 июля. названный ДНК-маркером (лестницей), нашел широкое применение в экспериментах по молекулярной биологии. В статье мы сообщаем о методе получения ДНК-маркера на основе метода множественной ПЦР. Фрагменты ДНК размером 100–1000 п.н. амплифицировали с использованием праймеров, сконструированных в соответствии с положением 6631 ~ 7630 лямбда-ДНК. Фрагменты ДНК-мишени амплифицировали с использованием ПЦР Touchdown в сочетании с ПЦР с горячим стартом соответственно, затем экстрагировали фенолом/хлороформом, осаждали этанолом и тщательно перемешивали. Результаты показали, что фрагменты ДНК размером 100–1000 п.н. были успешно получены в одной реакции ПЦР, полосы приготовленного ДНК-маркера были четкими, размер подходил и их можно было использовать в качестве контроля в молекулярно-биологическом эксперименте. Этот метод может сэкономить время и быть более дешевым, быстрым и простым по сравнению с текущими средствами, подготовленными с помощью ДНК-лестницы.
В области молекулярной биологии необходимо определить молекулярную массу (mw) или длину пары оснований (bp) нуклеиновых кислот. Эта потребность охватывает массу или длину нуклеиновых кислот от размеров в диапазоне от мега п.н. до очень коротких олигонуклеотидов всего в несколько п.н. Традиционно длину пары оснований нуклеиновой кислоты получают путем сравнения поведения анализируемой нуклеиновой кислоты с поведением другой нуклеиновой кислоты определенной длины и обычно, но не обязательно, с известной последовательностью. Такими способами могут быть электрофорез, гель-фильтрационная хроматография, ультрацентрифугирование и подобные способы, хорошо известные специалистам в данной области. Из-за простоты оборудования, простоты использования и разрешающей способности метода электрофорез является методом, наиболее часто используемым для определения размера нуклеиновых кислот.
Стандарты двухцепочечной ДНК обычно готовили из ДНК бактериофагов или плазмид [1, 2]. Этот процесс требует размножения вируса или плазмиды в соответствующем организме-хозяине, очистки вирусной или плазмидной ДНК от нуклеиновых кислот хозяина, расщепления очищенной ДНК эндонуклеазами рестрикции и очистки полученных фрагментов от непереваренная ДНК и фермент рестрикции. Этот процесс требовал больших затрат труда, материалов и оборудования, особенно для подготовки больших количеств ДНК. ДНК бактериофагов, расщепленных ферментами рестрикции, таких как Lambda, часто использовали в качестве маркеров молекулярной массы. Набор длин фрагментов в полученных п.н. зависел от природы рестриктазы, состава последовательности ДНК и используемых условий. Каждая комбинация рестрикционных ферментов, ДНК и условий давала уникальный набор фрагментов ДНК определенной длины [3, 4].
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) широко применяется в областях молекулярной биологии, генетики, биохимии, генной инженерии, криминалистики и т. п. ПЦР представляет собой простой, эффективный и удобный метод, с помощью которого можно получить большое количество олигонуклеотидов за очень короткое время. Однако подготовка ДНК-лестницы с использованием обычной ПЦР была трудоемкой. Различные стандартные фрагменты смешивали в определенной пропорции, амплифицировали и концентрировали из многих продуктов ПЦР. Таким образом, разные полосы могут быть стандартом для идентификации и оценки длины выборки. Однако большая часть лестницы ДНК имела слишком много полос, чтобы их можно было амплифицировать с помощью ПЦР, соответственно, что привело к большим человеческим ресурсам, материальным ресурсам и ресурсам богатства, хотя это были индустриализация, промышленность и секвенирование. Очень важно найти новый метод производства ДНК-лестницы, позволяющий быстро и просто снизить затраты и улучшить производство. Сначала в этом исследовании будет описан новый способ серийного производства.
2.1. Праймеры для ПЦР
Согласно последовательности ДНК фага лямбда (инвентарный номер GenBank: {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»J02459″,»term_id»:»215104″}}J02459 ), были отобраны и покрыты последовательности от 6631 до 7630 bp. Праймер 1000 п.н. представляет участок длиной от 6631–7630, 900 п.н. праймер от 6731–7630, 800 п.н. праймер от 6831–7630, 700 п.н. праймер от 6931–7630, 600 п.н. праймер от 7031–7630, 500 п.н. из 7131–7630, праймер из 400 п.н. из 7231–7630, праймер из 300 п.н. из 7331–7630, праймер из 200 п.н. из 7431–7630 и праймер из 100 п.н. из 7531–7630 целевой последовательности лямбда. Дезоксиолигонуклеотиды были синтезированы с использованием химии фосфорамидитов и были получены от Shanghai Sangon Company, Китай. Праймеры были показаны как на .
Таблица 1
Праймеры, использованные в эксперименте.
| Length (bp) | Primer | Position |
|---|---|---|
| 1000 | 5′-GCGGCACGGAGTGGAGCAAG-3′ | 6631 |
| 900 | 5′-GTTCGATCCGAAAGGCTGGGCGCT-3′ | 6731 |
| 800 | 5′-AAAGACCTGGGCAAAGCGGTGT-3′ | 6831 |
| 700 9’9GC-TCACGATG 5′ | 0203 | 6931 |
| 600 | 5′-ACGCCTCTGCCCGTTACCCGAA-3′ | 7031 |
| 500 | 5′-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTG-3′ | 7131 |
| 400 | 5′-CCGCTCGCTGGGTGAACAA-3 ′ | 7231 |
| 300 | 5′-ACGGATGAAACTGCCGGTCAGGACA-3′ | 7331 |
| 200 | 5′-TGGATACGTCTGAACTGGTCACGGT-3′ | 7521 |
| 100 | 5′-AACGGCGTTTCGTGTCTCTGCCGGT-3′ | 7531 |
| 0: | 5′-GTTATCGAAATCAGCCACAGGGC-3′ | 7630 |
Open in a separate window
2.
2. ПЦР-амплификация и подготовка ДНК-цепочки Фрагменты длиной 100–1000 п.н. амплифицировали с помощью мультиплексной ПЦР с использованием десяти пар праймеров в одной пробирке для ПЦР с одним и тем же смысловым праймером. Матричную ДНК (15–35 нг) добавляли к 25 мкл л реакционной смеси, содержащей 50 мМ KCl, 10мМ Трис-HCl (pH 8,3), 2,0 мМ MgCl9.0299 2 , 75 пмоль смыслового праймера, 5 пмоль каждого антисмыслового праймера размером 100–500 пар оснований, 10 пмоль каждого антисмыслового праймера размером 600–1000 пар оснований, 0,3 мМ dNTP и 5 единиц ДНК-полимеразы Taq. ДНК-полимеразу Taq добавляли методом горячего старта. ПЦР проводили с использованием термоциклера PxE (Thermo) с температурным профилем 35 циклов, который содержал 2 цикла при 95°С в течение 30 с, 56°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин, 2 цикла 95°С. для 30 с, 54°С для 30 с и 72°С для 1 мин, 2 цикла для каждого температурного интервала отжига 2 температура, до 44°С полировка 35 циклов. Продукты ПЦР выявляли в 2% агарозном геле при напряжении 120 В в течение 40 мин.
5 мк мкл каждой реакционной смеси для ПЦР подвергали скринингу с помощью электрофореза в 2% агарозном геле и определяли длину путем сравнения ДНК-маркера известного размера (Sangon), затем очищали и секвенировали компанией Sangon Company. Продукты ПЦР экстрагировали фенолом/хлороформом и осаждали этанолом, а затем анализировали их поглощение в УФ-излучении при 260 нм. 5 Аликвоту мк мкл материала подвергли электрофорезу, и после окрашивания бромистым этидием не наблюдали изменений в характере миграции полос или интенсивности полос. Затем маркер замораживали при -20°С.
Все фрагменты размером 100–1000 п.н. были успешно амплифицированы методом мультиплексной ПЦР путем оптимизации процесса в реакционной системе ПЦР и температурного профиля (). Наконец, с помощью метода сенсорной ПЦР и ПЦР с горячим стартом все десять фрагментов ДНК были получены с помощью мультиплексной ПЦР. Сначала в реакционную систему добавляли одинаковое количество десяти пар праймеров, и температурный профиль отжига от 58°С до 48°С в течение 30 циклов (), и температурный профиль отжига от 58°С до 48°С для Данным методом амплифицировали фрагменты длиной 100–500 п. н. 35 циклов (1). Регулируя количество десяти антисмысловых праймеров и температурный профиль отжига от 56°C до 46°C, было обнаружено большинство фрагментов-мишеней. () Наконец, увеличивая количество антисмысловых праймеров размером 600–700 bp и используя температурный профиль отжига от 56°C до 44°C, все целевые фрагменты амплифицируются, а неспецифические фрагменты исчезают ().
Открыть в отдельном окне
Иллюстрации продуктов ПЦР для настройки реакционной системы и профиля температуры. Фрагменты длиной 100–1000 п.н. амплифицировали с помощью мультиплексной ПЦР с использованием 10 пар праймеров в пробирке для ПЦР, имеющих один и тот же смысловой праймер. (а) профиль температуры отжига от 58°С до 48°С в течение 30 циклов; (б) Фрагменты размером 100–500 п.н. амплифицировали при температурном профиле отжига от 58°С до 46°С в течение 35 циклов. (c) Регулируя количество десяти антисмысловых праймеров и температурный профиль отжига от 56°C до 46°C, было обнаружено большинство фрагментов-мишеней; (г) При увеличении количества антисмысловых праймеров размером 600–700 п. н. и использовании температурного профиля отжига от 56°C до 44°C все целевые фрагменты амплифицируются, а неспецифические фрагменты исчезают.
ПЦР стала широко используемым инструментом для обнаружения, идентификации и дифференциации патогенных микроорганизмов при диагностике болезней животных и человека или других исследованиях [5]. Для различных целей исследования разрабатывалось все больше и больше производных методов ПЦР, например, метод мультиплексной ПЦР, который широко используется для обнаружения и идентификации некоторых неизвестных и возможных патогенных микроорганизмов при некоторых заболеваниях. Использование нескольких пар праймеров, каждая из которых имеет определенную специфичность, в одной и той же реакции добавило многомерную перспективу к диагностическому потенциалу ПЦР. Такая процедура позволяла одновременно обнаруживать два или более разных микробных агента в одном образце и включать внутренние контроли. Поскольку мультиплексная ПЦР включала гораздо более сложную реакционную систему, чем обычный симплексный режим, ее эффективность было труднее предсказать, и ее можно было оценить только после обширных испытаний [5]. Таким образом, целый ряд используемых в настоящее время протоколов может быть дополнительно оптимизирован для исключения неспецифических реакций. В настоящей работе в реакционную систему было добавлено десять пар праймеров для амплификации десяти различных фрагментов. Мы оптимизировали реакционную систему и реакцию, чтобы избежать неспецифических реакций, и димеры праймеров, последовательности-мишени, определенные сайтами связывания праймеров, были тщательно проверены, чтобы обеспечить высокую специфичность обнаружения. Кроме того, при использовании метода ПЦР с горячим стартом и приземлением можно было регулировать количество каждого праймера и температуру отжига для повышения эффективности реакции амплификации. Основная идея ПЦР с горячим стартом заключалась в снижении неспецифической амплификации в начальной фазе за счет высвобождения активного фермента только непосредственно перед первой стадией связывания праймера [6]. Другой вид ПЦР, сенсорная ПЦР, может разработать диапазон температур непрерывного и сенсорного отжига для амплификации некоторых фрагментов [7]. Этот подход был разработан для предотвращения образования димеров праймеров, неправильного запуска и спонтанной инициации синтеза цепи ДНК [8]. Наконец, с неоспоримым успехом десять фрагментов, основанных на мультиплексной ПЦР с сенсорной ПЦР и горячим стартом, были амплифицированы и четко обнаружены ().
По сравнению с обычными методами производства ДНК-маркеров, метод мультиплексной ПЦР может снизить затраты и увеличить производство в лаборатории. Несомненно, потребность в методе мультиплексной ПЦР в будущем будет увеличиваться из-за возможности снижения затрат, человеческих и материальных ресурсов и одновременного увеличения производительности для серийного производства.
Эта работа была частично поддержана грантами Фонда естественных наук провинции Хэнань, Китай (№ 511042300, 624410041) и Фонда научных и технологических инноваций Университета провинции Хэнань (2008HASTIT026).
1. Вэй Л.Дж., Вэй Ю.Т., Хуан XF, Вэй XQ, Хуан Р.Б. Конструирование нового типа ДНК-маркерного вектора. Биотехнология . 2004;14(5):33–35. [Google Scholar]
2. Zhu CJ, Wei QY, Qu WL, Ding H. Экспериментальное исследование по созданию нового маркера ДНК из положительных и отрицательных образцов ДНК. Acta Medicinae Sinica . 2005; 18: 937–938. [Google Scholar]
3. Хайман. ДНК-лестницы. Патент США №. 5,840,575, 1999.
4. Hu A-liW, Hartley JL, Jordan HJ. Лестницы нуклеиновых кислот. Патент США №. 6,924,098, 2005.
5. Хартли Дж.Л. Лестница маркеров нуклеиновых кислот для оценки массы. Патент США №. 7 132 520, 2006 г.
6. Доусон. Метод мультиплексного получения маркеров молекулярной массы нуклеиновых кислот и полученных продуктов. Патент США №. 5,714,326, 1998.
7. Korbie DJ, Mattick JS. Touchdown PCR для повышения специфичности и чувствительности ПЦР-амплификации. Природные протоколы . 2008;3(9):1452–1456. [PubMed] [Google Scholar]
8. Смолина И., Ли С., Франк-Каменецк М., И. И. Обнаружение малокопийных последовательностей геномной ДНК в отдельных бактериальных клетках с использованием амплификации по методу катящегося круга с помощью пептидных нуклеиновых кислот и флуоресцентная гибридизация in situ.
