Советы и рекомендации для лаборатории: устранение неполадок с колонками и альтернативные варианты
Колоночная хроматография — широко используемый метод очистки в лабораториях по всему миру. Если все сделано правильно, он может просто и быстро выделить нужные соединения из смеси. Но, как и во многих аспектах практической химии, быстрая и эффективная установка и запуск колонки — это то, на что могут уйти годы. Здесь мы приводим некоторые советы и рекомендации по работе с колонкой, поиску и устранению некоторых проблем, часто возникающих при колоночной хроматографии, а также некоторые «быстрые и грязные» альтернативы полной колонке.
Запуск колонки
Ранее мы рассмотрели, как наполнить колонку и как выбрать необходимое оборудование и растворители. После того, как вы настроите это, вы будете готовы загрузить и запустить свою колонку. Загрузка колонки включает в себя помещение образца непосредственно на верхнюю часть колонки и предоставление ему возможности абсорбироваться кремнеземом.
Для загрузки колонки:
- Растворите образец в минимальном количестве растворителя (5–10 капель). Можно использовать немного более полярный растворитель, чем тот, который вы будете использовать для колонки, если это способствует растворению образца. Если вам нужно использовать растворитель, такой как дихлорметан или что-то более сильное, метод сухой загрузки, описанный ниже, может быть предпочтительнее.
- С помощью пипетки или шприца с толстой иглой накапайте образец прямо на верхнюю часть силикагеля. Старайтесь не тревожить поверхность. В идеале образец должен быть равномерно распределен по поверхности так, чтобы он образовывал тонкую горизонтальную полосу.
- После добавления всего образца дайте колонке стечь, чтобы уровень растворителя коснулся верхней части силикагеля. №
- Аккуратно добавьте слой песка (около 2–5 мм). Это поможет предотвратить нарушение поверхности кремнезема при добавлении большего количества растворителя.
- Используйте пипетку, чтобы осторожно добавить больше растворителя, чтобы уровень растворителя был примерно на 10 мм выше поверхности песка.
- Дайте этому растворителю стечь, пока уровень растворителя не будет примерно на 1–2 мм выше верхней части песка.
- Повторите шаги 5 и 6 еще один или два раза. Это гарантирует, что ваш образец абсорбируется кремнеземом.
- Наконец, добавьте необходимое количество растворителя. Теперь вы готовы начать работу со своей колонкой.
Если ваше соединение плохо растворяется в системе растворителей, обеспечивающей наилучшее разделение, можно загрузить образец в колонку всухую.
Для сухой нагрузки вашего соединения, вам понадобится:
Круглую дно-колбу
сухой кремнез образец в соответствующем растворителе. Перелейте его в круглодонную колбу, если он еще не в ней.
Сбор фракций
Чтобы начать сбор фракций, поместите подходящий контейнер под колонку и откройте кран или кран.
Для каждой колонки существует оптимальная скорость потока. Отрегулируйте запорный кран, чтобы контролировать поток. При слишком малом расходе диффузионные процессы приведут к расширению полосы (рис. 1, а). Если слишком быстро, времени для уравновешивания не хватит, и соединение будет вытесняться по колонке, оставляя за собой длинный хвост (рис. 1, в). Для колонок малого диаметра оптимальная скорость ниже, чем для колонок большего диаметра. Следовательно, колонки большего размера могут работать с более высокой скоростью потока, чем колонки меньшего размера.
Рис. 1. Изменение скорости потока может изменить качество разделения. Оптимальный расход показан на b).
Ни в коем случае нельзя допускать, чтобы уровень растворителя опускался ниже уровня силикагеля («вытекать всухую»). Растворитель следует пополнять регулярно и задолго до того, как это может произойти. Долейте растворитель, когда над защитным слоем песка останется более 2 см растворителя.
Будет мертвый объем, в котором не будет сэмпла. Размер мертвого объема зависит от размера колонки и разделяемых соединений. Вы можете увидеть линию, соответствующую полярному растворителю, использованному для растворения образца. Это может быть хорошим руководством для того, когда вы должны начать собирать дроби. Если вы не видите линию от полярного растворителя, отметьте начальный уровень растворителя, нарисовав снаружи колонки непостоянной ручкой. Сделайте вторую отметку на колонке под первой, соответствующую двум третям длины кремнезема (рис. 2). Как только уровень растворителя упадет ниже второй отметки, самое время начать сбор фракций. Если у вас есть какие-либо сомнения относительно положения вашего соединения в колонке, начните собирать фракции раньше, а не позже.
Рисунок 2. Оценка мертвого объема.
Размер фракции
Для больших колонок нет смысла собирать много мелких фракций: в конечном итоге они будут рекомбинированы. Однако сбор только нескольких крупных фракций может означать, что вы получите две полосы в одной и той же фракции, особенно если полосы отрываются от колонки близко друг к другу или есть хвост ведущей полосы.
В качестве приблизительного ориентира по идеальному размеру фракции см. Таблицу 1.
Таблица 1. Приблизительные размеры фракций для колонок разного размера.
Как узнать, какая из собранных фракций содержит мой продукт?
Нанесите немного каждой фракции на пластину для ТСХ и проявите ее так же, как при тестовой ТСХ. Сделайте пластины для ТСХ большего размера, чем обычно (примерно 5 x 7 см), чтобы вы могли проверить 5–10 фракций на пластине.
Дополнительные сведения см.
в разделе Как запустить тестовый TLC.
Колоночная флэш-хроматография
Если вы используете флэш-колонку, есть еще один важный параметр, который необходимо контролировать: давление.
Давление газа обычно составляет 1–2 фунта на кв. дюйм. Это может быть выше (2–4 фунта на квадратный дюйм), если вы используете очень мелкий кремнезем. Для вязких растворителей, таких как бутанол или вода, также может потребоваться давление выше 2 фунтов на квадратный дюйм.
Абсолютный предел для стеклянных колонок составляет 7 psi !
Стеклянный вход для газа можно закрепить вручную или с помощью пластикового быстроразъемного хомута, потому что он сорвется, если давление станет слишком высоким. Использование других зажимов или методов крепления впускного отверстия для газа не рекомендуется. Стеклянные впускные отверстия для газа также могут разбиться, если сброс давления приведет к их падению или иному удару о твердую поверхность.
Устранение неполадок
Ранее мы рассмотрели, как наполнить колонку и как выбрать необходимое оборудование и растворители. Но независимо от того, насколько тщательно вы упаковываете колонку, выбираете растворители или запускаете колонку, все равно что-то может пойти не так. Во-первых, не паниковать; часто все не так плохо, как кажется на первый взгляд. Далее, помните, что вы не одиноки. Хотя каждая проблема уникальна, многие люди сталкивались с подобными проблемами и находили решения. Здесь мы представляем некоторые из наиболее распространенных проблем и их наиболее вероятные решения (табл. 2).
Таблица 2. Общие проблемы, возникающие при колоночной хроматографии, и их решения.
2D ТСХ
Двумерная ТСХ полезна для определения стабильности вашего соединения на силикагеле или для образцов, содержащих большое количество компонентов.
Для проведения 2D-ТСХ вам потребуется:
Лист ТСХ
Ножницы/нож Стэнли/канцелярский нож
Карандаш
Стеклянный контейнер, например, небольшой химический стакан с часовым стеклом или чашкой Петри крышка
Исследуемый(е) растворитель(и)
Капиллярный корректор для ТСХ или микропипетка (см. Как сделать капиллярный корректор для ТСХ)
Пинцет
УФ-лампа или раствор перманганата калия для визуализации ТСХ
Метод:
3, а). Пятно должно находиться примерно в 0,5–1 см от нижнего и левого краев и иметь диаметр 1–2 мм.
Рис. 3. Установка и процедура проведения двухмерной ТСХ для определения стабильности соединения на силикагеле.
Если вы обнаружите, что ваше соединение неустойчиво к диоксиду кремния, рассмотрите возможность использования оксида алюминия или альтернативного метода очистки, такого как кристаллизация или дистилляция. Также можно отложить очистку вашего соединения и перенести весь образец на следующий шаг в вашей последовательности. В зависимости от следующей реакции ваше соединение может быть преобразовано во что-то более стабильное по отношению к силикагелю и более легко очищаемое.
Альтернативы полным столбцам:
Столбцы могут занимать много времени и не всегда необходимы. Если ваш образец представляет собой твердое вещество, перекристаллизация может быть более быстрым и простым методом удаления примесей. Если ваш образец содержит только незначительные примеси, пробка из кремнезема может быть более быстрой альтернативой. Для небольших образцов (~ 50 мг и менее) микроколонка может быть запущена в несколько раз быстрее, чем полная колонка. Эти «быстрые и грязные» методы не обеспечивают такого же хорошего разделения, как полная колонка, потому что образец проводит меньше времени в контакте с силикагелем. Однако в условиях, описанных выше, они могут сэкономить много времени и ресурсов.
Кремнеземная пробка
Кремнеземная пробка является грубой альтернативой полной колонке. Он подходит только для образцов с высоким значением R f и небольшим количеством примесей, которые прилипают близко к базовой линии (рис.
4).
Рис. 4. Пример пластины для ТСХ, на которой показан образец, который может быть пригоден для очистки с помощью силикагелевой пробки.
Установка кремнеземной пробки аналогична колонне с фриттой, за исключением того, что она выполняется в воронке с фриттой и боковым ответвлением для подключения к вакуумной линии или водяному насосу (рис. 5). На дно воронки с фриттой насыпают тонкий слой песка, чтобы предотвратить прохождение кремнезема через фритту. Кремнезем помещается поверх песка методом суспензии (см. Наполнение колонны). Затем образец загружается на кремнезем так же, как и в колонке.
Рис. 5. Установка для запуска кремнеземной пробки.
Размер воронки и количество растворителя, собранного в виде фракций, будут зависеть от количества очищаемого образца. Фракции собираются в гораздо больших объемах, чем с помощью колонки. Типичные размеры фракций составляют 100–200 мл. Вы должны стремиться заполнить круглодонные колбы наполовину.
Если колбы заполнены более чем наполовину, вы рискуете потерять часть пробы в вакуумной линии или водяном насосе.
Если вы используете вакуумную линию, убедитесь, что вакуум не слишком высокий. Во избежание этого держите кран частично открытым. Высокий вакуум в системе может привести к ударам в колбе и потере образца через вакуумную линию. Высокий вакуум также затрудняет удаление вакуумной линии, что может привести к тому, что силикагель будет работать всухую, если вакуум не будет удален достаточно быстро. По этим причинам водяной насос предпочтительнее высоковакуумной линии.
Для запуска кремнеземной пробки вам потребуется:
Воронка с фриттой
Несколько круглодонных колб (рекомендуется 4–6. Всегда лучше иметь под рукой больше, чем вам действительно нужно)
Используемые растворители
Вакуумная линия или вода насос
Метод:
- Зажмите круглодонную колбу и поместите воронку с пористым стеклом сверху. №
- Добавьте в воронку слой песка (около 0,5 см).
- Добавьте кремнезем в воронку в виде суспензии. Также можно использовать метод сухой упаковки 2, но с учетом количества кремнезема и ширины воронки метод суспензии является очень быстрым и простым.
- Аккуратно постучите по стенке воронки пробковым кольцом или куском вакуумной трубки, чтобы помочь осесть кремнезему и удалить пузырьки.
- Добавляйте растворитель, пока воронка почти не заполнится.
- Ненадолго прикрепите вакуумную линию к боковому отверстию воронки. Удалите его, когда уровень растворителя будет примерно на 2–3 мм выше уровня кремнезема.
- Дайте растворителю стечь под действием силы тяжести, пока он не выровняется с кремнеземом.
- Промойте стенки воронки, пипетируя растворитель по бокам. Будьте осторожны, чтобы не нарушить поверхность кремнезема.
- Нанесите образец на кремнезем, равномерно нанеся его пипеткой на поверхность кремнезема.
- Добавьте достаточное количество растворителя, чтобы кремнезем не высох во время следующего шага (примерно 5 мм над уровнем кремнезема должно быть достаточно).
- Замените круглодонную колбу на пустую.
- Медленно добавляйте растворитель, чтобы не повредить поверхность.
- Вакуумируйте до тех пор, пока уровень растворителя не будет примерно на 2–3 мм выше уровня кремнезема.
- При необходимости повторите шаги 10–13.
- Протестируйте каждую фракцию с помощью ТСХ, чтобы определить, какая из них содержит желаемый продукт.
Микроколонка
Если у вас есть небольшой образец (< 50 мг), содержащий лишь незначительные примеси, использование микроколонки может избавить вас от необходимости проводить полную колонку. Микроколонки, как следует из названия, представляют собой миниатюрные колонки, которые можно быстро запустить. Они также идеально подходят для разделения, требующего градиента растворителя, так как растворитель добавляется в небольших количествах, поэтому часто можно разделить соединения с очень похожими значениями R f значений таким образом.
Микроколонка готовится с использованием обычной одноразовой стеклянной пипетки Пастера и настраивается почти так же, как колонка (рис.
6). Следует выбрать систему растворителей, которая дает более низкое значение R f , чем обычно, то есть значение R f , равное 0,2, подходит для микроколонки по сравнению со значением 0,3 для полной колонки.
Рис. 6. Установка для запуска микроколонки.
Для запуска микроколонки вам потребуется:
Одноразовая стеклянная пипетка (вторая пипетка может использоваться для настройки первой)
Вата или стекловата
Силикагель
Песок (дополнительно)
Груша для пипетки (для флэш-хроматографии)
Маленькая воронка/бумажная воронка
Метод:
- Закрепите пипетку в вертикальном положении с помощью зажимной стойки.
- Поместите небольшой шарик ваты или стекловаты в самое узкое место пипетки. Вторую пипетку можно использовать, чтобы поставить шарик на место. Шарик не должен быть слишком плотно упакован, так как это будет препятствовать потоку растворителя.
- Добавьте небольшое количество песка, чтобы обеспечить ровную поверхность для кремнезема (необязательно). Песок должен равномерно покрывать вату или стекловату, но не более 2 мм в толщину.
- Насыпьте сухой кремнезем в пипетку, используя небольшую воронку или бумажную воронку. Оставьте около 3–5 см свободного от кремнезема пространства вверху.
- Добавьте растворитель в верхнюю часть пипетки и дайте ему стечь. Грушу пипетки можно прикрепить к верхней части и сжать в этой точке, чтобы ускорить поток растворителя и способствовать более плотной упаковке кремнезема.
- Добавьте соединение и элюируйте как обычно. Используйте грушу пипетки, чтобы увеличить давление и скорость потока.
- Часто добавляйте растворитель, чтобы силикагель не высох.
Дополнительным преимуществом использования микроколонки является то, что после ее завершения ее можно утилизировать в контейнере для острых предметов без необходимости очистки.
Резюме
На этом мы завершаем наше исследование колоночной хроматографии.
Теперь вы должны быть в состоянии выбрать, какая система растворителей требуется для вашего образца, решить, какой размер колонки использовать, и узнать, сколько силикагеля необходимо. После того, как вы выбрали их, вам необходимо тщательно упаковать колонку, так как пузырьки воздуха и трещины в силикагеле могут свести на нет всю тщательную подготовку, которую вы проделали при выборе устройства. Мы видели, что размер собранных фракций зависит от размера колонки и R f и что скорость потока растворителя может влиять на разделение. Мы также рассмотрели некоторые распространенные проблемы, с которыми вы можете столкнуться, и способы их решения или даже избежания – и столбцы – с помощью одного из «быстрых и грязных» приемов.
Наконец, последний совет по работе с колонкой: НИЧЕГО не выбрасывайте, пока не будете полностью уверены, что дроби у вас есть именно те, которые вам нужны. Слишком легко предположить, что пятно, которое присутствует только в одной фракции, является незначительной примесью, когда на самом деле это продукт, который вы пытались получить в течение последних нескольких дней/недель/месяцев.
Глоссарий общих терминов, используемых при колоночной хроматографии
Колоночная хроматография | Метод очистки индивидуальных химических соединений из смесей |
Колоночная флэш-хроматография | Колоночная хроматография, выполненная под внешним давлением с помощью сжатого воздуха или N 2 . Это стало стандартным методом, а колоночную хроматографию часто называют гравитационной хроматографией, чтобы отличить ее. |
Неподвижная фаза/абсорбент/диоксид кремния | Твердый материал, используемый в колонне. Обычно кремнезем (SiO 2 ), но иногда оксид алюминия (Al 2 O 3 ). |
Подвижная фаза/Растворитель/Элюент | Жидкость слилась по колонке. |
Значение сетки | Значение сетки описывает размер частиц стационарной фазы. Высокие значения сетки означают более мелкие частицы. |
Глинозем типа I, II или III | Глинозем доступен в трех типах в зависимости от содержания воды. В типе I меньше всего воды, в типе III больше всего. |
Лента/точка/элюат | Раздел столбца, содержащий соединения. Полоса используется для обозначения фактического столбца, а пятно используется для описания ТСХ. |
Расширение ленты | Диффузионные процессы в колонке вызывают растекание пробы. Это расширение полосы неизбежно, но его можно свести к минимуму, сократив время нахождения образца в колонке. Правильная оптимизация всех параметров сведет к минимуму расширение диапазона. |
Хвосты/размазывание/размытие/растекание | Все термины, используемые для описания чрезмерного расширения полос на колонке или планшете для ТСХ, из-за которого полосы или пятна сливаются. |
Набивка колонки | Процесс настройки столбца. Включает добавление кремнезема, растворителя и обеспечение хорошего уплотнения кремнезема без пузырьков или зазоров. |
Загрузка столбца | Процесс добавления образца в начало столбца. Влажная загрузка включает растворение образца в минимальном количестве растворителя и пипетирование его сверху силикагеля. Сухая загрузка описана в статье выше. |
Запуск колонны | Процесс сбора и тестирования фракций по мере их элюирования с колонки. |
Для элюирования | Буквально: вымывать. Используется в хроматографии для обозначения «сойти с колонки». |
Дроби | Порции растворителя, собранные со дна колонны. |
Система растворителей | Комбинация двух или более растворителей, используемых в качестве подвижной фазы. |
Тонкослойная хроматография (ТСХ) | Хроматография на стеклянном или алюминиевом листе или пластинах, покрытых тонким слоем кремнезема или другой неподвижной фазы. Используется в качестве краткого руководства по колоночной и флэш-хроматографии. |
Капиллярный ТСХ Spotter/Spotter | Приспособление, используемое для добавления образца на пластину для ТСХ. (См.: Как сделать капиллярный ТСХ-корректировщик) |
Ч f Значение | Мера того, насколько далеко соединение или растворенное вещество перемещается в данном растворителе или системе растворителей. |
Передняя панель с растворителем | Передняя кромка растворителя. Это перемещает вниз по колонке, но вверх по пластине ТСХ |
Базовый уровень | В ТСХ — линия, на которой находится образец. Также верхняя часть колонки, куда загружается образец. |
Разрешено/разрешение/разделение | Мера того, насколько хорошо каждый компонент в образце изолирован от других компонентов. Хорошее разрешение или разделение означает, что каждый компонент можно чисто и легко собрать в отдельные фракции. |
Часто используется в лабораториях, но его следует избегать в формальной письменной/речевой форме. | |
В колонку/колонну | Может использоваться как глагол в лаборатории, но его следует избегать при написании. |
Работа всухую | Когда уровень растворителя падает ниже уровня кремнезема. Это может привести к образованию пузырьков и трещин в кремнеземе, что нарушит разделение соединений. |
Обычно собирают в пробирки в объеме 10–50 мл.
Предпочтительная фраза в статьях: «Х был очищен с помощью колоночной хроматографии» или «Х был очищен с помощью колоночной флэш-хроматографии».
Дополнительная литература:
- Высокоэффективная градиентная элюция,
Lloyd Snyder, John Dolan,
John Wiley & Sons, New York, USA, 2006 90.
ISBN: 978-0-471-70646-5
Также представляет интерес:
- Введение в современную жидкостную хроматографию,
Lloyd Snyder, Joseph Kirkland, John Dolan,
John Wiley & Sons, Нью-Йорк, США, 2010 .
ISBN: 978-0-470-16754-0
Есть ли у вас какие-либо советы или рекомендации по созданию идеальной колонки? Поделитесь ими в разделе комментариев …
DOI: 10.
1002/chemv.201200084
Написание столбцов | Добавочный номер MU
Отзыв от Кэтрин Форан
Дополнительные коммуникации и маркетинг
Дебра Джефферсон
Дополнительные сведения и сельскохозяйственная информация
Что такое столбец? Колонка — это не новостная статья, но это новость. Обычно это отвечает, почему и как. Часто это личное, с использованием первого и второго лица (я и ты). В колонке часто высказывается мнение. Говорят, что это похоже на написание открытого письма. Столбец также имеет стандартный заголовок, называемый заголовком, и подстрочный (имя) вверху. Они идентифицируют вас и вашу колонку для читателя.
Как написать столбец?
Прежде чем писать колонку, подумайте и определитесь с целью, аудиторией, содержанием и структурой.
Цель
Зачем ты пишешь? Это для информирования сообщества о событии? Хочет ли этого редактор газеты, сообщество или коллеги? Вы развлекаете, информируете или обучаете? Вы ищете личность или разоблачение?
Аудитория
С кем вы пытаетесь связаться? Кого вы достигаете? Определитесь со своей аудиторией.
Пишите на их языке, на их уровне, о вещах, которые аудитория должна знать или хочет знать.
Содержание
Что будет обсуждаться в вашей колонке? Как вы будете это обсуждать? Ответив на вопрос, почему и как, вы сможете определить, что именно. Помните, столбцы должны быть основаны на фактах и должны быть точными.
Имена имеют решающее значение в личной колонке. Личные колонки могут быть неформальными; однако точность и выбор материала имеют значение.
Структура
Как ваше сообщение попадет к вашей аудитории? Помимо личного столбца, существуют и другие типы столбцов. Некоторые из них охватывают определенные темы или типы информации. Это могут быть «вопросы и ответы», «новые идеи», «как это сделать» или «календари» и «ближайшие события».
Персональные столбцы должны иметь много локальных имен. Они также используют такие слова, как: «я», «мы» или «вы».
При написании колонки делайте
- Дайте читателю своевременную полезную информацию.
- Разработайте структуру и сохраните ее. Пишите по обычному графику.
- Пишите простые и короткие предложения и абзацы.
- В личных столбцах используйте местные имена и места.
- Пусть другие говорят за вас, используя цитаты и ссылки.
- Узнайте разницу между колонкой и новостным сюжетом.
При написании колонки не используйте
- технические или сложные слова, если это не требуется; тогда объясни просто.
- Говорите на жаргоне или незнакомых терминах.
- Постоянно говорить на одну тему.
- Слишком много деталей или материалов. Вы должны стимулировать интерес, а не исчерпывать тему.
- Ссылайтесь на себя как на третье лицо (этот автор, ваш репортер) или цитируйте себя (сказал Джимми Джонс). Вместо этого используйте мой .
Советы по написанию колонок
- Пишите так, как вы говорите. Но не отказывайтесь от хорошего использования английского языка и грамматики.
